微生物工程重点内容.pptx
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1、微生物工程的基本概念微生物工程的基本概念利用利用微生物微生物的特定性状和机能,通过现代化的特定性状和机能,通过现代化工程技术,工程技术,生产有用物质生产有用物质或或直接应用于工业化生直接应用于工业化生产产的技术体系;是将传统发酵与现代基因工程、的技术体系;是将传统发酵与现代基因工程、细胞工程、代谢工程、生物信息工程和计算机控细胞工程、代谢工程、生物信息工程和计算机控制等新技术结合并迅速发展起来的现代发酵技术。制等新技术结合并迅速发展起来的现代发酵技术。微生物工程是渗透有工程学的微生物学,微生物工程是渗透有工程学的微生物学,是发酵技术工程化的发展。是发酵技术工程化的发展。微生物工程发展简史微生物
2、工程发展简史1、传统的微生物发酵技术、传统的微生物发酵技术天然发酵天然发酵2、第一代微生物发酵技术、第一代微生物发酵技术纯培养技术纯培养技术3、第二代微生物发酵技术、第二代微生物发酵技术深层培养技术深层培养技术4、第三代微生物发酵技术、第三代微生物发酵技术代谢调控技术代谢调控技术5、第四代发酵技术、第四代发酵技术基因工程技术基因工程技术微生物工程微生物工程 微生物工程既基于微生物工程既基于生物学知识、生物学知识、又依托又依托工程概工程概念念,解决的是生物技术,解决的是生物技术产业化产业化进程中的关键问进程中的关键问题,被誉为工业生物技术的核心。题,被誉为工业生物技术的核心。借助于借助于微生物微
3、生物进行进行产品开发产品开发或或环境改造环境改造是微生是微生物工程物工程的基本内容和目标,涉及到解决人类的基本内容和目标,涉及到解决人类所面临的所面临的食品与营养食品与营养、健康与环境健康与环境、资源与能资源与能源源等重大问题,为人类社会带来巨大经济和社等重大问题,为人类社会带来巨大经济和社会效益。会效益。微生物工程的组成微生物工程的组成微生物学微生物学化学工程化学工程生物化学生物化学菌种的选育菌种的选育培养基的配制、灭菌、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种扩大培养和接种发酵过程发酵过程产品的分离提纯等产品的分离提纯等微生物发酵生产流程微生物发酵生产流程微微生物工程产品类型生物工程产品类型1.
4、微生物代谢产物发酵微生物代谢产物发酵2、微生物菌体的发酵、微生物菌体的发酵3、微生物的生物转化、微生物的生物转化初级代谢产物初级代谢产物l与菌体生长相伴随的产物,与菌体生长相伴随的产物,l氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂l菌体对其合成反馈控制严密,一般不过量积累菌体对其合成反馈控制严密,一般不过量积累次级代谢产物次级代谢产物l与菌体生长不相伴随,以初级代谢产物为原料而合成与菌体生长不相伴随,以初级代谢产物为原料而合成l 抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等l 结构常较复杂结构常较复杂对环境条件敏感对环境条件敏感1.微生物代谢产
5、物发酵微生物代谢产物发酵发酵生产产品的类型发酵生产产品的类型目的目的初级代谢产物初级代谢产物primary metabolite是指是指微生物微生物通过通过代谢代谢活动所产生的、自身生活动所产生的、自身生长和繁殖所长和繁殖所必需的必需的物质,如物质,如氨基酸氨基酸、核苷酸核苷酸、多多糖糖、脂类脂类、维生素维生素等。通过等。通过初级代谢初级代谢,能使营养,能使营养物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提物转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量,因此初级代谢产物,通常都是机体生存供能量,因此初级代谢产物,通常都是机体生存必不可少的物质,只要在这些物质的合成过程的必不可少的物质,只要在这些
6、物质的合成过程的某个环节上发生障碍,轻则引起生长停止,重则某个环节上发生障碍,轻则引起生长停止,重则导致机体发生突变或死亡,是一种基本代谢类型。导致机体发生突变或死亡,是一种基本代谢类型。次级代谢产物次级代谢产物secondary metabolite是指是指微生物微生物生长到一定阶段才产生的生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能,或功能,或并非是并非是微生物生长和繁殖所必需微生物生长和繁殖所必需的物质,如的物质,如抗生素抗生素、毒素毒素、激素激素、色素色素等。等。不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不同种类的微生物所产生的次级代谢产
7、物不相同,他们可能积累在细胞内,也可能不相同,他们可能积累在细胞内,也可能排到外环境中。排到外环境中。2、微生物菌体的发酵、微生物菌体的发酵SCP、药用真菌(冬虫夏草、茯苓等)、药用真菌(冬虫夏草、茯苓等)生物防治制剂(如苏云金杆菌)生物防治制剂(如苏云金杆菌)活性乳酸菌制剂、食用和药用酵母活性乳酸菌制剂、食用和药用酵母细胞的生长与产物的积累成平行关系,细胞的生长与产物的积累成平行关系,生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段3、微生物的生物转化、微生物的生物转化 利用微生物细胞的一种或几种酶,对外利用微生物细胞的一种或几种酶,对外源化合物的特定部位进行加工
8、,如源化合物的特定部位进行加工,如加入羟基、加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链还原双键、脱氧或切断支链等。等。转化的最终产物并不是微生物细胞利用营养物转化的最终产物并不是微生物细胞利用营养物质经细胞代谢产生,而是微生物细胞的酶或酶系作质经细胞代谢产生,而是微生物细胞的酶或酶系作用于底物的某一部位,进行特定部位的化学反应而用于底物的某一部位,进行特定部位的化学反应而形成。形成。反应最显著的特点是特异性强,包括反应特异性、反应最显著的特点是特异性强,包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性结构位置特异性、立体特异性4)微生物特殊机能的利用)微生物特殊机能的利用 利用微生物消除环境污染利用微生物保
9、持生态平衡 利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等(氧化硫杆菌、排硫杆菌、脱氨硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌(如芽孢杆菌属、土壤杆菌属)等。)利用基因工程菌生产动、植物细胞产品工业微生物的特点1、概念(什么是工业微生物)从来源于自然界大量的微生物中分离并筛选出有用菌种,再加以改良,贮存待用于生产的微生物称为工业微生物。通常在发酵过程作为活细胞催化剂 传统的工业微生物包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。目前最有应用前景的工业微生物:基因工程菌株2、工业微生物种类、工业微生物种类2.1原核细胞类微生物原核细胞类微生物:细菌、放线菌、立细菌、放线菌、立克次氏体、衣原体等克次氏体、衣原体等2.2真核细胞类微生物真
10、核细胞类微生物:酵母菌和霉菌,单酵母菌和霉菌,单细胞藻类、原生动物等细胞藻类、原生动物等2.1非细胞类微生物(主要作为基因工程的非细胞类微生物(主要作为基因工程的载体)载体):RNA病毒(逆转录病毒)病毒(逆转录病毒)DNA病病毒(腺病毒)毒(腺病毒)3、微生物的特点、微生物的特点3.1 种类多 3.2 分布广 3.3 体积小3.4 繁殖快 3.5 代谢强 3.6 易变异(1 1)廉廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。价原料、生长迅速、目的产物产量高。(2 2)易易于控制培养条件,生产效率于控制培养条件,生产效率高高。发酵周期较。发酵周期较短。短。(3 3)抗杂菌和噬菌体的能力)抗杂菌和噬菌体
11、的能力强强。(4 4)菌种遗传性能)菌种遗传性能稳稳定,不易变异和退化,定,不易变异和退化,不产生不产生任何有害的生物活性物质和毒素,任何有害的生物活性物质和毒素,保证安全生产。保证安全生产。(5 5)产品容)产品容易易分离提纯。对分离提纯。对于胞外产品,细胞膜具有良好的渗透性,或者细胞膜的渗透性可以调节,细胞不易发生菌体自溶;对于胞内产品,要求菌体易分离和收集,菌体易破碎。二、工业化菌种的要求二、工业化菌种的要求微生物与工业生产二、人类是如何利用微生物进行工业生产的呢?(通过微生物工业生产想获得什么?)1.获取菌体物质,例如蛋白、脂肪和糖类。2.获取微生物的代谢产物,例如抗生素、乙醇、甘油等
12、等。3.利用微生物的酶作为活化剂进行产品加工。基因工程菌与传统工业微生物的差别前者含有带外源基因的重组载体;而后者是单一的微生物细胞;前者需要发酵条件满足外源基因的表达,后者则只需要满足细菌本身的生长和代谢需要要获得高水平的产品,基因工程菌生产过程中往往使用高密度发酵基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体的高密度发酵和诱导条件的确定。培养基的主要成分及作用培养基的主要成分及作用 一、碳源一、碳源主要功能:主要功能:1 1)为菌体的生长繁殖提供能源和合)为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所成菌体所 必需的成分;必需的成分;2 2)为合成目的产物提供所需的碳素)为合成目的产物提供所需的碳素成分
13、成分常用的碳源常用的碳源:特殊情况下(如碳源贫乏时),蛋白质水解物或氨特殊情况下(如碳源贫乏时),蛋白质水解物或氨基酸等也可被微生物作为碳源使用。基酸等也可被微生物作为碳源使用。糖类糖类 发酵培养基中使用最广泛的碳源发酵培养基中使用最广泛的碳源;主要有葡萄糖、糖蜜主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等和淀粉糊精等油脂油脂 这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶,在脂肪酶的作用下,这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶,在脂肪酶的作用下,油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸,在溶解氧的参与下,进一步氧油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸,在溶解氧的参与下,进一步氧化成化成CO2和和H2O,并释放出大量的能量。,并释放出大量的能量。
14、当微生物利用脂肪作当微生物利用脂肪作为碳源时,要供给比糖代谢更多的氧,不然大量的脂肪酸和代谢为碳源时,要供给比糖代谢更多的氧,不然大量的脂肪酸和代谢中的有机酸会积累,从而引起中的有机酸会积累,从而引起pH的下降,并影响微生物酶系统的下降,并影响微生物酶系统的作用。的作用。常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等有机酸有机酸 一些微生物对多种有机酸(如乳酸、柠檬酸、乙酸等)一些微生物对多种有机酸(如乳酸、柠檬酸、乙酸等)有很强的氧化能力,可以有机酸或有机酸盐作为碳源。有很强的氧化能力,可以有机酸或有机酸盐作为碳源。有机有机酸的利用常会使酸的利用
15、常会使pH上升,尤其是有机酸盐氧化时,常伴随着碱上升,尤其是有机酸盐氧化时,常伴随着碱性物质的产生,使性物质的产生,使pH进一步上升。进一步上升。低碳醇等低碳醇等二、氮源二、氮源有机氮源有机氮源:豆饼(粕)粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、:豆饼(粕)粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆、尿素等玉米浆、尿素等无机氮源:无机氮源:铵盐、硝酸盐等(由于细胞内的含氮物质都以氨基或铵盐、硝酸盐等(由于细胞内的含氮物质都以氨基或亚氨基的形式存在,故铵态氮可以直接用于合成细胞物质;而硝态亚氨基的形式存在,故铵态氮可以直接用于合成细胞物质;而硝态氮需还原成氨后才能被利用)氮需还原成氨后才能被利用)分
16、类:无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用,为速效分类:无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用,为速效氮;氮;蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用,蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用,属迟效氮属迟效氮氮源物质常对培养液氮源物质常对培养液pH产生影响产生影响在常用的无机氮中,硫酸铵被菌体利用后会使培养液在常用的无机氮中,硫酸铵被菌体利用后会使培养液的的pH下降,为生理酸性物质;下降,为生理酸性物质;硝酸钠被同化时则引起培养液硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升,为生理碱性物质上升,为生理碱性物质三、无机盐和微量元素三、无机盐和微量元素 磷酸盐:磷酸盐:磷是某些蛋白质和核酸的组成成
17、分磷是某些蛋白质和核酸的组成成分磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用微生物对磷的需要量一般为微生物对磷的需要量一般为0.0050.01mol/L常用常用K3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4 钾盐:钾盐:钾不参与细胞结构物质的组成钾不参与细胞结构物质的组成是许多酶的是许多酶的激活剂激活剂菌体生长所需钾量约为菌体生长所需钾量约为0.1g/L(以以K2SO4计计)微量元素微量元素:需量微少,但又不可缺少需量微少,但又不可缺少一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中,本身含有,一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中,本身含有,不必另加不必另加某些金属离子,特别是汞离子和铜离子,
18、具有明显的某些金属离子,特别是汞离子和铜离子,具有明显的毒性毒性 硫酸镁:Mg 2+是许多重要酶(如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等)的激活剂镁离子能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身所产的抗生素的耐受能力,如卡那霉素、链霉素、新生霉素等产生菌。硫存在于细胞的蛋白质中,是含硫氨基酸的组成成分硫是构成一些酶的活性基硫酸镁加入培养基中,在碱性条件下会形成氢氧化镁沉淀,配料时要注意。四、生长因子四、生长因子概念:概念:微生物生长不可缺少的微量有机物质。微生物生长不可缺少的微量有机物质。类别:类别:维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍物维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍物提供生长因子的农副产品原料提供生
19、长因子的农副产品原料1)玉米浆)玉米浆用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液,也是玉米淀用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液,也是玉米淀粉生产的副产品粉生产的副产品虽然主要用作氮源,但它含有丰富的氨基酸、核虽然主要用作氮源,但它含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等,常用作为提供生长因子的物质。酸、维生素、无机盐等,常用作为提供生长因子的物质。2)麸皮水解液:)麸皮水解液:可代替玉米浆,蛋白质、氨基酸等营养成分比玉可代替玉米浆,蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。米浆少。用量一般为用量一般为1%(以干麸皮计)左右(以干麸皮计)左右3)糖蜜)糖蜜甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆,但氨基酸等有机氮
20、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆,但氨基酸等有机氮含量较低含量较低甘蔗糖蜜用量为甘蔗糖蜜用量为0.1%0.4%4)酵母酵母:酵母膏、酵母浸出液、酵母粉酵母膏、酵母浸出液、酵母粉5)其他:)其他:牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富的生长因子的生长因子五、水五、水生理功能:1)是微生物机体的重要组成部分)是微生物机体的重要组成部分2)进行代谢反应的介质)进行代谢反应的介质3)营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后)营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后才能通过细胞表面进行正常的活动;才能通过细胞表面进行正常的活动;4)水的比热高,能有效吸收
21、代谢过程中放出)水的比热高,能有效吸收代谢过程中放出的热,使细胞内温度不致骤然上升;同时水的热,使细胞内温度不致骤然上升;同时水又是热的良导体,有利于散热,可调节细胞又是热的良导体,有利于散热,可调节细胞温度。温度。1 1、培养基分类:、培养基分类:按培养基成分按培养基成分1 1)合成培养基:)合成培养基:所用原料的化学成分明确、稳定所用原料的化学成分明确、稳定如如葡萄糖、硫酸铵葡萄糖、硫酸铵适于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等适于研究菌种基本代谢和过程的物质变化等科研工作;在生产某些疫苗的过程中,为了防止异性蛋白质等科研工作;在生产某些疫苗的过程中,为了防止异性蛋白质等杂质掺入,也常用合成
22、培养基;杂质掺入,也常用合成培养基;营养单一、价格较高,不适营养单一、价格较高,不适于大规模生产于大规模生产2 2)天然培养基:)天然培养基:原料是一些天然动、植物产品原料是一些天然动、植物产品如花如花生饼粉、蛋白胨等生饼粉、蛋白胨等来源广泛(大多为农副产品)、营养丰富、来源广泛(大多为农副产品)、营养丰富、价格低廉、适于工业化生产价格低廉、适于工业化生产一般不需要另加微量元素、维生素一般不需要另加微量元素、维生素等物质等物质由于成分复杂,不易重复,如对原料质量等方面不加控由于成分复杂,不易重复,如对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性制会影响生产稳定性3.半合成(组合)培养基:半合成(组合
23、)培养基:在合成培养基的基础上添加在合成培养基的基础上添加些天然成份,以更有效地满足微生物对营养物的需要些天然成份,以更有效地满足微生物对营养物的需要如马铃薯如马铃薯-蔗糖培养基蔗糖培养基3 3、根据培养基用途来分根据培养基用途来分基础培养基基础培养基富集培养基富集培养基选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基按生产工艺来分按生产工艺来分孢子培养基孢子培养基种子培养基种子培养基发酵培养基发酵培养基1)孢子培养基:)孢子培养基:供菌种繁殖孢子的培养基,常用固体培养基。供菌种繁殖孢子的培养基,常用固体培养基。孢子培养基基本要求:孢子培养基基本要求:基本要求是能使菌体迅速生长,产生较多优质孢基本要求
24、是能使菌体迅速生长,产生较多优质孢子,且不易引起菌种发生变异。子,且不易引起菌种发生变异。配制时需注意配制时需注意A)营养不要太丰富(特别是有机氮源),否则不易产孢子。B)所用无机盐的浓度要适量,否则会影响孢子量和孢子颜色。C)注意pH和培养基的湿度。常用孢子培养基常用孢子培养基 麸皮培养基 小米培养基 大米培养基 玉米碎屑培养基 用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基 注意:注意:大米和小米常用作霉菌孢子培养基,因为它们含氮量少、疏松、表面积大,是良好的孢子培养基。2)种子培养基:供孢子发芽、生长和菌体繁殖的培养基。)种子培养基:供孢子发芽、生长和菌体繁殖的培养基。营养要求比较
25、丰富和完全,氮源和维生素的含量也要高些,但总浓度以略稀薄为好,这样可达较高的溶解氧,供大量菌体生长和繁殖。种子培养基的成分要考虑在代谢过程中能维持稳定的pH,其成分还要根据不同菌种的主要特征而定。3)发酵培养基:)发酵培养基:供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。供菌体生长、繁殖和合成大量代谢产物用的培养基。要使种子接入后能迅速生长,达到一定的菌体浓度又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。因此发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外,还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等。基础培养基:基础培养基:是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养成
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