细胞融合及应用.pptx
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1、第七章第七章 细胞融合与应用细胞融合与应用第一节第一节 细胞融合概述细胞融合概述细胞融合(细胞融合(cell fusion)cell fusion),又称体细胞杂交(somatic hybridiazation),是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。一、细胞融合的定义一、细胞融合的定义uMuller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uLuginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个观察到脊椎动物
2、(蛙类)的血液细胞发生融合的过程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。u1958年日本学者冈田(Okada)发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇(PEG)化学融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。二、细胞融合研究历史二、细胞融合研究历史生物种类生物种类生物种类生物种类细胞来源细胞来源细胞来源细胞来源成功年代成功年代成功年代成功年代烟草两个种间
3、烟草两个种间烟草两个种间烟草两个种间苷蓝苷蓝苷蓝苷蓝青菜青菜青菜青菜大豆大豆大豆大豆马唐草马唐草马唐草马唐草矮牵牛矮牵牛矮牵牛矮牵牛龙面花龙面花龙面花龙面花大麦大麦大麦大麦花生花生花生花生大麦大麦大麦大麦大豆大豆大豆大豆小麦小麦小麦小麦矮牵牛矮牵牛矮牵牛矮牵牛油菜油菜油菜油菜大豆大豆大豆大豆玉米玉米玉米玉米大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆大豆野豌豆野豌豆野豌豆野豌豆大麦大麦大麦大麦蚕豆蚕豆蚕豆蚕豆大豆大豆大豆大豆草香木犀草香木犀草香木犀草香木犀酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌鸡鸡鸡鸡大豆大豆大豆大豆烟草烟草烟草烟草大豆大豆大豆大豆秋水仙秋水仙秋水仙秋水仙人人人人胡萝卜胡萝卜胡萝卜胡萝卜番茄番茄番茄番茄马铃
4、薯马铃薯马铃薯马铃薯人人人人小鼠小鼠小鼠小鼠叶叶叶叶叶叶叶叶叶叶叶叶根根根根愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织叶叶叶叶叶叶叶叶花瓣花瓣花瓣花瓣种子种子种子种子种子种子种子种子叶叶叶叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶花瓣花瓣花瓣花瓣叶叶叶叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶根根根根悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶原生质体原生质体原生质体原生质体血红细胞血红细胞血红细胞血红细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶腹水癌细胞腹水癌细胞
5、腹水癌细胞腹水癌细胞原生质体原生质体原生质体原生质体叶叶叶叶根尖根尖根尖根尖纤维肉瘤细胞纤维肉瘤细胞纤维肉瘤细胞纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞畸胎瘤细胞畸胎瘤细胞畸胎瘤细胞197219721972197219721972197319731974197419741974197419741974197419741974197419741975197519761976197619761976197619761976197619761978197819781978几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的右瓶为地面融合的细胞,左瓶中为太空微重
6、力环境下融合的细胞细胞,左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞 动物细胞融合实验使用的小白鼠 三、动植物细胞的融合过程三、动植物细胞的融合过程植植物物细细胞胞融融合合过过程程人人造造小小鼠鼠培培育育过过程程示示意意图图四、细胞融合的意义四、细胞融合的意义u理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。u融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组,从而产生新的核外遗传系统。u淋巴细
7、胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。第二节第二节 细胞融合的基本原理细胞融合的基本原理显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解第三节第三节 细胞融合的常用方法细胞融合的常用方法物理法:显微操作,电场刺激等物理法:显微操作,电场刺激等物理法:显微操作,电场刺激等物理法:显微操作,电场刺激等化学法:硝酸钠诱导、化学法:硝酸钠诱导、化学法:硝酸钠诱导、化学法:硝酸钠诱导、PEGPEGPEGPEG结合高结合高结合高结合高pHpHpHpH,高钙离子,高钙离子,高钙离子,高钙离子法法法法p167
8、p167p167p167生物法:仙台病毒法生物法:仙台病毒法生物法:仙台病毒法生物法:仙台病毒法一、仙台病毒法一、仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段:仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段:两种细胞在一起培养,加入病毒,在4条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚;在37中,病毒与细胞膜发生反应,细胞膜受到破环,此时需要Ca2+和Mg2+,最适PH为8.0一8.2;细胞膜连接部穿通,周边连接部修复,此时需Ca2+和ATP;融合成巨大细胞,仍需ATP。基本原理:是利用病毒具有凝集细胞的能力基本原理:是利用病毒具有凝集细胞的能力基本原理:是利用病毒具有凝集细胞的能力基本原理:是利用病毒具有凝集细
9、胞的能力病毒法的主要步骤病毒法的主要步骤1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近;2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透,胞质互相渗透;3.两个原生质体的细胞核互相融合,两个细胞融为一体;4.进入正常的细胞分裂途径,分裂成含有两种染色体的杂种细胞。用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 u聚乙二醇(PEG)结构为:HOH2C(CH20CH2)nCH2OH,分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。uPEG浓度以W/W;如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合(假定1ml培养液为1g重),即成50PEG溶液。uPEG
10、经高压灭菌后,与温热的Engle氏液混合。u通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好,50PEG溶液能产生最多杂交细胞。uPEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。u优点是易得,用法简单,融合效果稳定。二、聚乙二醇(二、聚乙二醇(PEG)法)法聚乙二醇(聚乙二醇(PEG)法细胞融合过程)法细胞融合过程PEG的作用机理:Kao等认为,由于PEG分子具有轻微的负极性,故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键,从而在质膜之间形成分子桥,其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合;另外,PEG能增加类脂膜的流动性,也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。PEG诱导融合的特点:其优点是
11、融合成本低,勿需特殊设备;融合子产生的异核率较高;融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害。(1)将两种不同亲本细胞各5l06混匀;(2)离心沉淀,吸去上清液;(3)加1ml50PEG溶液,用吸管吹打,使之与细胞接触1分钟;(4)加9ml培养液,离心沉淀,吸去上清液;(5)加5ml培养液,分别接种5个直径60mm平皿,每个平皿加培养液至5ml,37的CO2培养箱中培养。(6)624小时后,换成选择培养液筛选杂交细胞。聚乙二醇(聚乙二醇(PEG)法细胞融合步骤)法细胞融合步骤PEGPEG诱导的细胞融合过程示意图诱导的细胞融合过程示意图 三、电融合法三、电融合法电融合法是
12、80年代出现的细胞融合技术,在直流电脉冲的诱导下,细胞膜表面的氧化还原电位发生改变,使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭和成完整的膜,形成融合体。电融合法的优点:电融合法的优点:u融合率高、重复性强、对细胞伤害小;u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程;u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。细胞膜的接触:当原生质体置于电导率很低的溶液中时,电场通电后,电流即通过原生质体而不是通过溶液,其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子,从而使原生质体紧密接触排列成串;膜的击穿:原生质体成串排列后,立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿,从而导致两个
13、紧密接触的细胞融合在一起。电融合法的基本过程电融合法的基本过程电融合诱导法原理示意图电融合诱导法原理示意图第三节第三节 杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型,可将其分为以根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型,可将其分为以下几种类型:下几种类型:u异核细胞:非同源细胞的融合体。u同核细胞:两个相同细胞的融合体。u多核细胞:含有双亲不同比例核物质的融合体。杂种细胞筛选方法:杂种细胞筛选方法:n n1遗传互补筛选法遗传互补筛选法 n n2抗性互补筛选抗性互补筛选 n n3生长特性筛选法生长特性筛选法 n n4物理特性筛选法物理特性筛选法 n n5其它方法其它方法u基于
14、酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选u具有所需性状杂种细胞的筛选常用的杂种细胞筛选方法常用的杂种细胞筛选方法第四节第四节 细胞融合技术应用举例细胞融合技术应用举例 n n动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体生产单克隆抗体生产 n n利用原生质体融合和培养技术培育新植利用原生质体融合和培养技术培育新植物物 n n微生物原生质体融合构成新菌株微生物原生质体融合构成新菌株一、何谓单克隆抗体?一、何谓单克隆抗体?应用应用1 1:细胞杂交瘤技术与单克隆抗体:细胞杂交瘤技术与单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体只针
15、对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。T淋巴细胞淋巴细胞:即胸腺依赖淋巴细胞(thymusdependentlymphocyte)。亦可简称T细胞。来源于骨髓的多能干细胞(胚胎期则来源于卵黄囊和肝)。目前认为,在人体胚胎期和初生期,骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内,在胸腺激素的诱导下分化成熟,成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居,并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环,发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质,加强免疫应答,较长期保持免疫记忆。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志,主要是表面抗原和表面
16、受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。人类免疫系统的介绍人类免疫系统的介绍 外分泌淋巴系统:呼吸道和生殖泌尿系统外分泌淋巴系统:呼吸道和生殖泌尿系统内分泌淋巴系统:胸腺、骨髓、脾脏、扁桃体、淋巴结等内分泌淋巴系统:胸腺、骨髓、脾脏、扁桃体、淋巴结等B淋巴细胞淋巴细胞:来源于骨髓的多能干细胞。在禽类是在法氏囊内发育生成,故又称囊依赖淋巴细胞(bursadependentlymphocyte)/骨髓依赖性淋巴细胞简称B细胞,是由骨髓中的造血干细胞分化发育而来。与T淋巴细胞相比,它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后,会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。成熟的B
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