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DNA 损伤与肿瘤发生的研究进展损伤与肿瘤发生的研究进展 谢成英综述蔡育军 丁健审校出处：317中国癌症杂志2006 年第 16 卷第 4 期基金项目:“抗肿瘤药物临床前药效学关键技术及平台研究”滚动课题(2004AA2Z3811)。通讯作者:丁健E-mai:l jdingmai.l shcnc.ac.摘要生物体基因组时刻都暴露在体内外各种应激因素的作用下,即使在非常健康的细胞其基因组 DNA 的完整性也持续受到威胁。DNA 在细胞内外各种因素的作用下可不断产生损伤,如体内代谢过程中产生的自由基和其它活性化合物,DNA 在复制和重组过程中自发的错误;环境中的紫外线和离子辐射以及一些化学物质均能损伤 DNA。细胞能通过周期阻滞修复 DNA 或者细胞凋亡对 DNA损伤产生反应。细胞对 DNA 损伤反应的异常将导致肿瘤的发生。本文综述当前对 DNA 损伤修复和凋亡的分子调控以及它与肿瘤发生的研究进展。关键词DNA 损伤;DNA 修复;细胞周期阻滞;细胞凋亡;肿瘤发生中图分类号:R730.1文献标识码:A文章编号:1007-3639(2006)04-0313-05Advances in research on DNA damage response in tumorigenesisXIE Cheng-Ying,CAI Yu-Jun,DING Jian(Division ofAnti-TumorPharmacology,StateKeyLaboratory ofDrugResearch,ShanghaiIn-stitute ofMateriaMedica,ChineseAcademy ofSciences,Shanghai,201203,China)Correspondence to:DING JianE-mail:jding AbstractThe genomic DNA of the organism is often exposed tomany kinds of stress factors.The integrity of ge-nomic DNA is constantly under threat,even in perfectly healthy cells.DNA damage can result from stochastic errors in thereplication or recombination ofDNA,or from the action of endogenous free radicals and active compounds,aswell as from environmental stress factors likeUV and ion radiation.Cells can be arrested at some phase of the cell cycle to facilitateDNA repair or induced into apoptosis afterDNA damage.Carcinogenesis could result from the abnormal response of cells to DNA damage.This review describes currentunderstanding of themolecular control ofDNA damage-induced repair and ap-optosiswith particular attention to its role in tumorigenesis.Key wordsDNA damage;DNA repair;cell cycle arrest;cell apoptosis;tumorigenesis DNA 是机体生命活动最重要的遗传物质,其分子结构完整性和稳定性的保持对于细胞的存活和正常生理活动的发挥具有重要意义。但是 DNA 时刻面临来自于生物体内部或外部的侵袭,在细胞内外各种因素的作用下可不断出现损伤。尽管如此,细胞仍能保持正常的生长、分裂和繁殖,很明显基因组的稳定性和完整性处于连续不断的、有效的监控之下。生物体基因组完整性的维持依赖于体内相互独立但又密切联系的两套系统:DNA 修复和凋亡。细胞通过周期阻滞修复DNA 或者细胞自杀对 DNA 损伤产生反应。细胞对 DNA 损伤异常反应将导致肿瘤的发生,对 DNA 损伤反应的深入研究有助于人们进一步认识肿瘤的本质,以更好地提高癌症的治疗和预防。1DNA 损伤的诱发因素DNA 是生物遗传信息的主要载体,DNA 在细胞内外各种因素的作用下可不断产生损伤,DNA 损伤剂广泛存在于体内外,归纳起来可分为两类:1.1环境因素即外源性因素,包括物理因素和化学因素。目前已证明的引起DNA 损伤的物理因素主要有重金属、高温高压、各种电离及非电离辐射(如 UV)和机械力作用等,可引起 DNA 单、双链断裂,形成各种二聚体。引起 DNA 损伤的化学因素主要有强氧化剂、强酸、强碱和各种化学诱变剂等。这一因素造成的DNA 损伤主要使碱基丢失、核苷酸结构变异以及 DNA 链发生断裂。临床应用的 DNA 损伤类化疗药物(如烷化剂、DNA 拓扑异构酶抑制剂)即是利用这一原理,通过直接或间接损伤 DNA 而发挥抗肿瘤作用,并且其抗肿瘤效应与其 DNA损伤能力密切相关。1.2内部因素即 DNA 本身的因素。DNA 分子本身可以发生一些自发性的损伤,据统计,每个细胞的 DNA 在 24 h 内出现约 1 万次的损伤。DNA 在复制和重组过程中,由于其 4 种碱基:腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧呤(C)和胸腺嘧呤(T)结构的相似性和自由能差异或其他原因可发生碱基错配、碱基的脱氨基、脱嘌呤、脱嘧啶以及碱基的修饰。此外,细胞正常代谢过程中产生的活性产物(如活性氧)也可攻击 DNA,造成 DNA 损伤。目前对 DNA 本身因素导致的损伤作用机制不甚清楚。2细胞对 DNA 损伤的反应当处于增殖或静息的细胞受到 DNA 损伤的刺激时,基因组的完整性面临威胁,将产生一系列生物学效应。这些效应最终将导致DNA 修复以维持细胞生存或死亡。其效应的产生取决于 DNA 损伤的程度和细胞的生理状态。在一个特殊类型的细胞中目前仍不清楚何种因子决定其效应。推测那些具有内在过度增殖潜能的细胞更易转化以维持 DNA 损伤,因而 DNA 损伤耐受阈值更低。2.1细胞对 DNA 损伤的修复一般的观点认为细胞针对 DNA 损伤的第一反应是修复。当 DNA 损伤有望修复时,细胞将启动修复系统修复损伤的 DNA。DNA损伤将使细胞在周期检查点停滞。这种停滞使细胞在重新复制和有丝分裂前有足够的时间进行有效的 DNA 修复,因而可防止遗传病变繁殖导致的基因组的不稳定性1。这种修复反应通常是可逆的。射线或某些化疗药物作用于原代培养的成纤维细胞可激活这种类型的 DNA 损伤反应2。2.2DNA 损伤诱导的细胞凋亡当 DNA 损伤严重、修复无望时,细胞走向程序性死亡,以消除受损的细胞,避免将错误的遗传信息传递给子细胞或是发生恶性转化。这种不可修复的 DNA 损伤将杀死各种类型的细胞。不同类型的哺乳动物细胞对 DNA 损伤诱导凋亡的敏感性存在很大的差异。淋巴细胞对 DNA 损伤以及其他刺激更易产生凋亡,即使在受到很小的 DNA 损伤刺激的情况下也会发生自杀反应,而这种损伤在其他类型的细胞中能够修复3。相反,在原代培养的成纤维细胞中很少会出现 DNA 损伤诱导的细胞凋亡。这些不同的凋亡阈值,反应了细胞内存在不同的前凋亡和抗凋亡调节组成部分。3DNA 损伤反应介导的信号通路DNA 损伤刺激产生一个信号,这一信号最终将被细胞周期或凋亡调控系统所接受。研究表明:细胞周期阻滞和凋亡诱导是通过部分重叠而又明显不同的信号转导通路完成。Ataxia telangiectasiamutated(ATM)蛋白激酶家族是 DNA 损伤反应的核心组成部分,其中包括 ATM、ATM-Rad3-related(ATR)、DNA-dependentpro-tein kinase(DNA-PK)和 fluorescence recovery afterphotobleaching(FRAP)1,4-5。这些大分子蛋白是DNA 损伤识别的重要组成部分,部分蛋白从酵母(Rad3、MEC-1、TEL-1)到人(ATM 家族)是高度保守的。DNA 损伤可激活 ATM 激酶,后者磷酸化其下游的反应元件,使细胞在细胞周期关卡处停滞分裂,损伤的 DNA 获得时间进行有效的修复,若修复失败则细胞进入凋亡过程。其中 MRN(Mre11-Rad50-Nbs1)复合体是ATM 的重要效应器。DNA 损伤后染色体的缔合,ATM 的自身磷酸化都需要该复合体的存在6-7。但是也有研究报道在 Nbs1 突变的细胞中 ATM 也能发生低水平的自身磷酸化8。ATM 主要对 DNA 双链断裂发生反应并且它的激活比 ATR 更快。与 ATM 不同 ATR 可对广泛的 DNA 损伤发生反应,ATR 激酶激活它的主要靶标关卡激酶(checkpointkinase 1,Chk1)需要相关蛋白 ATRIP 和蛋白复合体 RAD17 和 9-1-1(RAD9-RAD1-HUS1)9。DNA-PK 的主要功能是识别和修复 DNA 双链断裂。总而言之,DNA 损伤通过刺激感受器(sensor proteins)如 ATM 家族蛋白激酶,检测 DNA 的结构异常并启动检控点信号;损伤信号通过转导因子(signal relay proteins)诸如 Chk1/Chk2,经级联转导过程激活相应的效应分子(effector proteins)如 Cdc25A、Cdc25C 和 p21;效应分子则引发一系列的下游生物学事件,对受损的 DNA 有效修复,细胞周期阻滞或凋亡(图 1)1,5。图 1DNA 损伤反应介导的信号通路Fig.1Signaling pathways in the response to DNA damage3.1DNA 损伤修复DNA 损伤修复是保持细胞基因组完整性的重要机制。DNA 损伤修复是一个多因素共同参与、多步骤的复杂过程。针对不同形式的损伤其修复方式也大不相同(图 2)10,在哺乳动物中 DNA 修复方式主要有以下几种:碱基切除修复(base excision repair,BER),主要负责切除或替换由内源性化学物质引起的碱基修饰或单链断裂;核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER),针对 DNA 链螺旋扭曲损伤、链内交联及某些形式的氧化损伤;错配修复(mismatch repair,MMR),主要针对一些由 DNA 损伤试剂引起碱基错配以及在 DNA 复制和重组过程中单个碱基的错配和小的插入或缺失,通过不同的MMR 蛋白 MSH2 和 MSH6(MutS),或 MSH2 和 MSH3(MutS)可识别碱基错配11;同源重组(homologous recombina-tion,HR)和非同源末端连接(nonhomologous end-joining,NHEJ),主要针对 DNA 双链断裂的修复,同源重组涉及 Rad51、Rad52、Rad54 蛋白,非同源末端结合修复涉及 DNA-PKcs、Ku70、Ku80、DNA ligase和 XRCC4 蛋白12。这些修复通路被来自ATM相关 DNA 损伤效应激酶激活。3.2DNA 损伤和细胞周期阻滞无论是 DNA 损伤修复还是凋亡诱导,首先会引起细胞周期停滞。ATM 和 ATR 识别 DNA 损伤后,能够磷酸化 p53。在许多类型的细胞中抑癌基因 p53 是 DNA 损伤诱导的细胞周期阻滞的重要调节者13-15。在 G1/S 检查点,DNA 损伤可引起 p53 依赖的周期阻滞。正常情况下细胞内p53 表达水平很低,当细胞受到 DNA 损伤刺激时 p53 的表达量和活性迅速升高。p53 可引起多种基因的转录,如:p21、Mdm2、Bax。p53 对 DNA 损伤诱导的p21cip1/WAF1 的表达和 G1 期阻滞是至关重要的,p53 可通过转录诱导 p21,抑制与cyclin E、cyclinA 相结合的 CDK 的活性,并由此使细胞阻滞于 G1/S 检查点。S期检查点对于维持基因组的稳定性具有重要的意义,但 S 期 DNA 损伤的检查点机制尚不明确,有研究表明,S 期阻滞需要 ATM 介导的 Nbs1 的磷酸化作用16,ATM-Nbs1-Smc1 通路是 S 期调控的重要机制17。DNA 损伤也可诱导细胞阻滞于 G2/M 期检查点。G2 期 DNA 损伤检查点是阻止带有 DNA 损伤的细胞进入有丝分裂期的最后一道关卡。DNA 损伤后 ATM 通过激活 Chk1/2,使 Cdc25 磷酸酶磷酸化失活。激酶对刺激该过程是重要的,该过程将介导细胞进入有丝分裂18。除了 CDKs 的磷酸化抑制作用外,p53 也可以在 G2/M 检查点的调节中发挥作用。DNA 损伤后,p53 的表达量和活性增加,引起 p21 和 14-3-3 表达上调,14-3-3 与周期素 B 的结合增强,抑制周期素入核。此外,p53 还可通过诱导周期阻滞和 DNA 损伤诱导因子 GADD45 的表达,加速 CDK1-cyclinB1复合物分解2,19。DNA 损伤诱导的 G2/M 期阻滞作用也可不依赖于 p53 蛋白,如:起动 射线和 DNA 损伤药物诱导的 G2/M 期周期阻滞不需要 p53 和其效应蛋白 CDK 抑制子 p21cip1/WAF1,但是它们对进一步维持其周期阻滞具有重要作用。p53 和 p21cip1/WAF1 突变的细胞株过早离开 G2/M 期周期阻滞,进入有丝分裂或启动 DNA 复制。这将引起基因组的不稳定,最终导致癌突变的积聚20。3.3DNA 损伤和细胞凋亡抑癌基因 p53 被认为是一个“基因卫士”,除了上面所述的在 DNA 修复和周期调控中起重要作用,p53 在细胞受到各种应急刺激包括 DNA 损伤诱导的细胞凋亡过程中起决定性的作用。DNA 损伤无法修复时p53 可激活某些基因的转录,如 Noxa、Bax、PUMA、Fas 以及参与氧 315中国癌症杂志2006 年第 16 卷第 4 期化应激反应的相关基因,诱导细胞凋亡5,21-22。Chk2 是 p53 活性和反式激活的重要的调节因子。激活 Chk2 可导致 ATM依赖和非依赖性的 p53 介导的细胞凋亡23-24。p53 在 DNA 损伤诱导的细胞凋亡中起重要的作用,但是并非在所有的细胞中其细胞凋亡作用依赖于抑癌基因p53。DNA 损伤可诱导 p53 依赖和非依赖性的细胞凋亡(图 3)5。DNA 损伤诱导的 p53 非依赖性细胞凋亡可通过 Chk2 活化核 promyelocytic leukaemia(PML)蛋白25-26;此外,Chk2 也能磷酸化激活转录因子 E2F-127,E2F-1 的表达可调节大量的凋亡因子,如 p53 相关蛋白 p7328。4细胞对 DNA 损伤反应与肿瘤的发生细胞对 DNA 损伤反应的异常将导致肿瘤的发生。对基因敲除小鼠和具有遗传突变患者的研究表明那些影响细胞对DNA 损伤反应(损伤识别、信号传播或效应阶段)的缺失能够导致癌症的发生。如前面所述的 ATM 蛋白激酶,其主要功能涉及识别 DNA 损伤,当这种蛋白激酶功能缺陷时,可引起多种临床症状,如对射线极度敏感、小脑神经细胞变性、不育症、生长延迟、免疫缺陷和肿瘤易患性等。毛细血管共济失调症(ataxia-telangiectasia,AT)是人类常染色体隐性遗传病,是由于编码 ATM 的基因缺陷所引起的多组织器官的损伤性疾病。ATM 相关的 DNA 损伤信号激酶ATR 和 DNA-PKcs 以及它的相关组分 Ku70 和 Ku80 也被认为是一个肿瘤抑制因子8。与调节细胞对 DNA 损伤效应的重要角色相一致,转录因子 p53 和它直接的激活者 Chk2 为防止细胞转化增加了障碍。p53 与肿瘤的发生发展有密切的关系,其功能失活是人类肿瘤中非常普遍的现象,在所有人类肿瘤中有大约半数存在 p53 的突变29。转录因子 IRF-1 也是 DNA 损伤反应的重要调节因子,并且p53-/-IRF-1-/-双缺失的小鼠比 p53-/-缺失的小鼠更易形成肿瘤30。此外,激活下游 p53 和 IRF-1 的凋亡效应因子和调节因子的反常也能促进细胞的转化。例如,表达转基因 Bcl-2 可促进淋巴瘤形成。尽管 Bcl-2 不仅能抑制 p53 介导的凋亡还可影响其它的凋亡通路,但因为 p53 缺失不仅能抑制某些凋亡通路也能下调细胞周期调控,故 p53 缺失比过表达 Bcl-2 具有更强的致瘤性31。归纳起来,DNA 损伤效应组分缺失促进细胞转化和诱发癌症主要有 3 个原因:DNA 修复不良,细胞周期检查点消失,细胞凋亡减少,所有这些缺失均可导致潜在致癌突变的积聚。5展望哺乳动物中存在复杂的机制去检测 DNA 损伤和启动一系列的生物学效应导致细胞周期阻滞,DNA 修复以维持细胞进一步生存或者诱导凋亡。DNA损伤的效应器以及修复机器被证实对机体的正常生长发育是极其重要的。细胞对 DNA 损伤反应的异常能引起发育异常和诱发癌症。并且,细胞对 DNA 损伤反应也能影响未转化细胞和肿瘤细胞对射线和化疗药物的敏感性。DNA 损伤药物的研究是抗肿瘤药物研发中的一个主要领域,必须深入研究 DNA 损伤所介导的信号通路及相关信号分子,寻找针对这些靶标的有效新分子。参考文献1Abraham RT.Cell cycle checkpoint signaling through the ATMand ATR kinases J.Genes Develop,2001,15(17):2177-2196.2KastanMB,ZhanQ,El-DeiryWS,eta.l Amammalian cell cy-cle checkpointpathway utilizing p53 andGADD45 is defective inataxia-telangiectasia J.Cell,1992,71(4):587-597.3Cohen JJ,Duke RC,Sellins KS,et a.l Apoptosis and pro-grammed cell death in immunity J.Annu Rev Immunol,1992,10:267-293.4DurocherD,Jackson SP.DNA-PK,ATM and ATR as sensors ofDNA damage:variations on a theme J.Curr Opin Cell Biol,2001,13(2):225-231.5Norbury CJ,Zhivotovsky B.DNA 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