细胞工程新版.doc

细胞工程一、 名词解释：细胞全能性:指分化细胞保存着所有的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的所有遗传信息，具有发育成完整的个体的潜能。愈伤组织：由脱分化的细胞通过度裂产生的无组织结构无明显极性的松散细胞团，它具有再分化成为完整植物体的潜能。外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，随着营养的消耗和代谢产物的积累，需将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代或传代培养。胚状体：离体培养条件下没有通过受精过程而形成的胚胎类似物。植物组织培养： 在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等外殖体，培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽等，或者长成新的完整植株一种实验技术。人工种子：将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在具有和保护功能的人工胚乳和人工种皮形成的颗粒。人工授精：指将采集的精子注入发情解决的母体内完毕受精过程。 PGD试管婴儿：通过种植前遗传学诊断（PGD）技术哺育出的试管婴儿将被称为第三代试管婴儿。 胚胎工程：又叫发育工程。重要是对哺乳动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育，获得人们所需要的成体动物的技术。 超数排卵：运用促性腺激素解决，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，运用手术的取出卵母细胞。目的是最大限度地运用母畜的生殖能力。 胚胎移植：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎从供体母畜取出（也可是体外发育的胚胎），移植到此外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的相应部位。 胚胎分割：借助显微操作技术或徒手操作方法，切割初期胚胎成2、4等多等份，再移植给受体母畜，从而制造同卵多仔后代的技术。胚胎分割是扩大胚胎运用率的一种有效途径。 试管动物：又叫体外受精动物。将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎，然后将发育到一定限度的胚胎移植入受体完毕发育出生的动物。细胞重组：细胞重组又叫细胞拆合，指从活细胞中分离出细胞器及其组分，在体外将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。微细胞:又可被称为微核体，是指具有一条或几条染色体（即只含一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。核质体:与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。 胞质体:是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。胞质杂种: 将两种来源不同的核外遗传物质与一个特定的核组合在一起得到的细胞。 原生质体: 将细胞壁除去后得到裸露的球形细胞。细胞融合:又称体细胞杂交，是指用人工的方法使二个或二个以上的细胞或原生质体(除去细胞壁的细胞) 融合成一个细胞的技术。染色体工程：按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术，从而达成定向改变遗传性和选育新品种的目的。广义上讲它还应涉及染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。 单倍体：细胞中具有正常体细胞的一半染色体数，即具有配子染色体数目的个体。 多倍体：指每个体细胞中具有三个或更多染色体组的个体。温度休克法：克制细胞分裂 重要用于三倍体诱导等，涉及冷休克法和热休克。略高于致死低温为冷休克，温度在05；温度略低于致死高温为热休克，温度在30左右。胚胎融合：是将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或所有细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌合体后代的技术。植物细胞培养:在离体条件下，将分离的植物细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。植物细胞两相培养技术: 在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上下两相，细胞在水相中生长合成次生代谢物质，分泌出来的产物被转移至有机相中的培养技术。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 原代培养：是指将机体取出的细胞或组织进行培养，在初次传代前的培养。 传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。 单克隆抗体：通过免疫哺乳动物单一的B淋巴细胞,可以分泌单一抗体,这种具有特异性的、同质性的抗体。 HAT培养基：其有三种成分：H:次黄嘌呤、A:氨甲蝶呤、T:胸腺嘧啶核苷。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中通过补救途径合成DNA，又能长期存活与繁殖。ES细胞胚胎干细胞简称ES细胞，是一种全能干细胞，它是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化克制培养分离的一种全能性细胞系，可分化成任何一种组织类型的细胞。成体干细胞：成体组织内具有进一步分化潜能的细胞，是多能或者单能干细胞。多能干细胞：可以形成两种或着两种以上类型细胞的干细胞。 转基因动物：是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且可以稳定地遗传给后代的遗传工程动物。 组织工程：是应用生命科学、医学和工程学原理与技术，运用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一种技术。二、 问答题：1试述植物组织培养的环节。（1） 材料选择与解决：培养材料的选择：一般采用茎尖、根尖等幼嫩部位等。材料的消毒：自来水清洗、酒精浸泡、漂白粉饱和溶液或氯化汞溶液消毒、无菌水冲洗。(2) 制备外植体：在无菌的环境中切取生长点位置的外植体一般0.5厘米左右。(3) 接种与培养：无菌条件下，将切好的外植体立即接种在合适培养基上，封口，保持一定温度，培养。（4） 芽球增殖：将获得的新生材料分株或者切段，转入增殖分化培养基中继代培养长成侧芽或不定芽，一般1个月左右。（5） 长成完整植株（母瓶）：转入生根培养基中培养，1个月左右生根，发育成完整植株。（6）扩充多个子瓶培养：分株、分瓶。（7）练苗、移栽:将培养容器打开，室内自然条件下适应一段时间。取出试管苗，移栽到合适基质中。一段时间后，移栽到大田土壤中。进一步发育成完整植株。2试述植物组织培养的意义（1） 无性系快速繁殖技术：组织培养与传统的无性繁殖相比，工作不受季节限制，并且通过组织培养进行无性繁殖，具有用材少、速度快等特点。特别对一些繁殖系数低、不能运用种子繁殖的名、优、特植物品种的繁育意义重大。（2） 获得无病毒植株：很多农作物都带有病毒，特别是无性繁殖植物，病毒积累，危害加重。对于花卉则影响了花卉的欣赏效果，对于经济作物也会影响产量。 通过组织培养获得的种植的作物就不会或很少发生病毒病害。（3） 新品种选育：运用组织培养技术进行新品种选育具有效率高、周期短、纯度高等优点。 （4） 在遗传、生理生化和病理等研究上的应用：组织培养由于能快速、大量地获得性状一致的实验材料，从而大大地推动了植物遗传、生理生化和病理等领域的研究进程。（5） 种质资源的保存：具有独特遗传性状的生物物种的灭绝是一种不可挽回的损失。运用植物组培和细胞低温保存等方法保存种子，可大大节省人力、物力，大大延长保存期。同时也便于种子资源的互换和转移，防止病害。（6）产业化前景：花卉种苗的产业化生产、蔬菜、水果种苗的脱毒、瓜果组培苗的产业化生产。3试述细胞培养的灭菌方法和各自的合用范围。（一） 物理灭菌方法：（）湿热消毒：即高压蒸汽灭菌法。使用最广最有效的消毒方法。重要用于培养液、培养器皿等灭菌。（2）紫外线消毒：只合用于空气和物体表面的灭菌，一般规定紫外灯距离地面不超过2.5m为宜，消毒物品是不宜互相遮挡。（3）过滤除菌：重要用于气体的除菌。（二） 化学消毒法 ：常用的是70%的乙醇，重要用于操作者皮肤、操作台表面及无菌室内的壁面解决。（三）抗生素消毒：在细胞培养时，在培养基中加入青霉素等抗生素克制细菌、真菌等污染。4试述人工种子的制作流程。1选取目的植物2诱导愈伤组织3愈伤组织增生4由愈伤组织获得体细胞胚5选用合适的介质包埋体细胞胚，其基质中具有必需的营养物质、生长因子等成分6包裹形成人工种皮。5试述细胞冻存和复苏的重要方法。6试管动物哺育的环节是什么?1、精子的采集与体外获能，卵子的采集与成熟培养：采集精子并选择有活力的精子。精子的体外获能：钙离子、血清蛋白有助于精子的体外获能。卵母细胞成熟的标志：生发泡破裂；染色体凝集；极体排出；透明带软化；卵丘细胞扩展。2、体外受精：精子发生顶体反映时，精子顶体外膜与其相贴的卵细胞膜发生多点融合而破裂，继而出现小孔。精子顶体内膜与卵细胞质膜互相融合，最终雄体原核和雌体原核合二为一，完毕受精过程。3、受精卵与胚胎体外培养：受精成功的标志至少是看受精卵是否可以发育至桑葚胚或囊胚期阶段。4、胚胎移植：受体的选择：与供体发情周期同步、无疾病、繁育史好的雌性动物。移植方法：手术法和非手术法。5、体内发育、出生。7试述实行胚胎工程的意义1、发挥优良母畜的繁殖能力：试管动物繁殖技术可以充足运用母体繁殖能力，满足大规模、快速繁殖优良动物品种的需要。2、促进家畜改良的速度3、保存遗传资源：由于胚胎超低温冷冻技术在生产中的应用，可以对优良或稀有哺乳动物建立“胚胎库”4、辅助技术：不仅应用于畜牧生产，也已经成为克隆动物、转基因动物、胚胎干细胞分离和性别控制等研究的辅助技术。8试述哺乳动物胚胎保存的方法1、 非冷冻保存：1）异种动物体内保存法：又称为中间受体培养法，是指把一种动物的胚胎，移入另一种动物的输卵管或子宫内，短期保存后再取出的方法。2）卵和胚胎的37保存法是指在37下，短时间保存。3）卵和胚胎冷藏保存法一般在04左右保存。2、冷冻法：是指196保存胚胎，此技术为建立优良品种的胚胎库或基因库提供了条件，同时也便于胚胎的运送与移植。常用的抗冻保护剂：渗透型冷冻保护剂（甘油、二甲亚砜、丙二醇和乙二醇等）、非渗透型冷冻保护剂(单糖、二糖、三糖、聚乙烯基吡咯烷酮、清蛋白）、抗冻蛋白。冷冻方法：程序冷冻法和玻璃化冷冻法。9细胞核移植克隆动物的技术路线1、核供体细胞的选择（胚胎细胞/胚胎干细胞/成体细胞）与细胞核的获得；2、核受体细胞体外培养的选择（为成熟的卵母细胞）与细胞核的去除（显微去核/射线去核/化学法去核）；3、细胞核移植：将供体核移植入已去核的受体细胞内。常用方法胞质内注射和透明带下注射两种方法；4、重组胚泡的激活(电激活和化学激活)；5、重组胚的培养和移植：体内培养激活的重组胚 桑椹胚/囊胚 胚胎移植；6、体细胞核移植后代的鉴定10体细胞克隆的应用与意义1、检查动物细胞全能性 ；2、加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物；3、运用转基因克隆动物进行生物药物的生产；4、异种器官移植（结合基因特异基因的敲除）；5、治疗性克隆（可以用患者本人细胞哺育出新组织。）11试述细胞重组的方式（1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。（2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。（3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。12细胞融合的方法有哪些？各有何特点？1、 生物法：有仙台病毒法等。 各种病毒都具有凝集细胞的能力。仙台病毒除有凝集细胞的能力外，还具有促使凝集的细胞发生融合的能力。缺陷：融合随机，融合率低，不够方便，目前已很少使用。2、 化学法：最常用的方法：PEG结合高Ca2+-高pH诱导法诱导。融合成本低，产生异核率高，不受物种限制，融合率较高，但过程繁琐，也许对细胞有毒害。3、物理法：重要采用电融合诱导法。优点：融合率高、反复性强、对细胞伤害小；方便简朴、可在显微镜下观测或录像融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。缺陷：也许导致不可恢复的细胞损伤。13叙述原生质体的纯化、活力鉴定与培养方法1、原生质体的纯化：（1）离心沉淀法：将含原生质体和酶液的滤液低速离心，原生质体沉于管底，反复离心3-4次。该法操作简便，但原生质体得率低且易损伤。（2）漂浮法：原生质体相对密度低，将滤液在一定浓度的溶液中低速离心，原生质体漂浮于溶液的表面。该法原生质纯净、完整，但得率低。（3）界面法：运用高分子聚合物混合液产生两相水溶液的特点，通过离心使原生质体处在两液相的中间。该法原生质体的完整，得率高。内酯酶（能透过质膜） 2、活力鉴定：（1）染色法：二乙酸荧光素（FDA）法。原理：FDA 有荧光、极性的荧光素（不能透过细胞膜）结果：产生荧光的是有活力的原生质体酚藏花红（0.001%)染色法：有活力的原生质体吸取染料显示红色，无活力不能染色伊文思蓝（0.25%)染色法： 有活力的原生质体不吸取染料，无活力显示蓝色。（2）渗透压变化：有活力的原生质体在低渗液是体积膨胀，在高渗液中体积缩小，无活力的原生质体无体积的变化。（3）胞质环流法：有活力的原生质体能在显微镜下观测到胞质环流现象。3、培养方法：（1）液体培养法：纯化后的原生质体悬浮于液体培养基中进行培养。原生质体的起始浓度在104106个/ml之间。（2）固体平板培养法：将一定量原生质体接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养。（3）双层培养法：在琼脂培养基上部加入一薄层液体原生质体培养原生质体14试述多倍体诱导的方法和各自的特点。广泛应用的诱导方法有化学方法、物理学和生物学。化学法：常用的化学物质重要有：细胞松驰素B：能克制肌动蛋白聚合成微丝，从而克制细胞质分裂。秋水仙素：可以克制细胞分裂中纺锤丝的形成，因而可以克制有丝分裂。通常以植物茎端分生组织或发育期的幼胚为材料。根据不同情况可以选择浸渍法、涂抹法、棉花球滴渍法、喷雾法、注射法、药剂培养基法等。 有效浓度一般在0.01-0.4%，以0.2%左右的浓度最为常用。 解决时间一般不少于24小时。解决温度：一般在18-25之间。物理法：重要用于动物多倍体的诱导。常用的物理方法是温度休克法和水静压法解决动物受精卵。（1）温度休克法：涉及冷休克法和热休克法。优点：便宜、解决量大、易操作。缺陷：诱导率低。（2）水静压法： 用较高的水静压解决受精卵。优点：容易掌握，解决程序易标准化。诱导率高、对受精卵损伤小、成活率高。缺陷：成本高，需专门设备，且样品室容量有限，不宜大规模生产，该法使染色体发生凝缩。生物学方法：重要是通过杂交方法特别是种间杂交获得异源多倍体。15试述多倍体倍性的鉴定的方法。1、 染色体计数法：由于染色体制片技术比较成熟，因此染色体计数仍是目前鉴定多倍体倍性的一种最为直观、准确的方法，但缺陷是比较费时。2、 核体积测量法：一般细胞核的体积与染色体数目成正比，可借测定细胞核的体积鉴定染色体的倍性。比较费时，缺少准确性。3、 DNA含量测定：是倍性鉴定的另一个比较有效的直接鉴定的方法。是较为先进常用的方法，其测定快速准确，并能测出嵌合体，但是缺陷是这种仪器比较昂贵。4、生化分析：根据二倍体与多倍体间也许存在的不同组织细胞蛋白和酶的活性差异，通过生化方法进行分析鉴定。不具有普遍性的意义。16单倍体的特点及人工获得单倍体的方法。特点：单倍体植物的有点在于单倍染色体；细胞全能性；叶小株矮，生活能力弱，高度不育；种质纯，不受显性等位基因的遮蔽影响，同时单倍体技艺发现产生的突变，在育种方面缩短了育种年限，克服了远缘杂交不亲和，提高了诱变育种效率，并且可以合成育种新材料。获得方法：（1）自然界的自然发生：自发产生单倍体株的机率很低，小于千分之一；（2）人工诱导；1、组织培养：花粉和花药培养：由花粉（小孢子）通过度裂分化直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株；2、核置换；3、染色体的消失；4、物理因素诱导：X射线解决花粉后授粉诱发孤雌生殖。17体外植物细胞培养的特点是什么与微生物细胞相比，植物细胞要大很多（30-100倍）。很少以单一细胞形式悬浮生长 ，常以非均相集合细胞团的方式存在。植物细胞的纤维素细胞壁和大的液泡很容易被剪切力高的传统搅拌式微生物反映器损伤。植物细胞生长速度慢，操作周期长。植物细胞培养基成分丰富而复杂劳动，适合微生物生长，防止污染的发生更困难。与微生物不同，植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对培养过程影响较大。18植物细胞固定化培养有什么优点细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小，利于采用传统的生物反映器进行大规模培养细胞密度高于悬浮培养且利于传质细胞生长缓慢，利于次生代谢产物的积累增长了细胞间的接触和信息传递，有助于代谢产物的合成有助于进行连续培养和生物转化。19叙述植物单细胞制备方法与培养方法制备方法：A、机械法：重要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的细胞。该方法是一种原始的方法，效率很低，获得的细胞数量也非常有限。B酶解法：这种方法是目前最为有效的一种获得细胞的方法。重要是根据植物细胞壁的组成特点选用某一专一性水解酶，在温和条件下将壁物质分解掉，从而释放出细胞。C愈伤组织诱导法：该方法通过植物组织培养获得愈伤组织，并通过培养使愈伤组织大量增殖。由于愈伤组织细胞之间的结构非常松散，因此可以通过高频率振动从悬浮状态的愈伤组织中振荡下来单个细胞，也可以添加酶使细胞分离下来。培养方法：分为初步培养和继代培养。初步培养A看护培养：具体方法是将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点：简便、成功率高。缺陷：不能在显微镜下直接观测。B饲养层培养饲养层培养是用解决过的无活性的或分裂很慢或不分裂的细胞来饲养所需培养的细胞使其分裂生长。继代培养：A平板培养法：将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养。B液体培养法：将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口培养。生长速度快,易于镜检与添加培养液。20如何的植物细胞才是适合作为植物细胞培养的细胞系？分散性好，适合大规模悬浮培养。均一性好，细胞大小、生理状态一致。生长速度快，培养周期短，不易染菌。目的产物含量高，容易分离提取。细胞稳定遗传。21体外培养的动物细胞按粘附性特点可分为几类？各有何特点？(一) 粘附型细胞：粘附生长是细胞之间互相接触或是细胞与细胞外基质结合。 动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长。分为四种类型1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连。3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以拟定其规律和稳定的形态，可统归于此类。(二)非粘附型细胞：A、体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。B、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。这类细胞形态学特点是胞体始终为球形。C、悬浮培养类似微生物的深层培养。D、细胞密度一般都较高，培养的效率高、操作也容易。E、易于大规模生产，便于过程的控制。F、可惜能在悬浮状态下生长的细胞种类有限。22试述动物培养基的种类和各自的重要特点。分天然培养基、合成培养基无血清培养基。天然培养基：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好。缺陷：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。合成培养基：重要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺陷： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。需补充一定量的天然培养基（常为10%小牛/胎牛血清）。无血清培养基是在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁因子等。由基础培养基和替代血清的补充成分组成。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可反复性和稳定性。23与微生物细胞相比，动物细胞在体外培养有何不同？（1）动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。（2）动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易受污染。（3）培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。（4）动物细胞间重要以聚集体形式存在。（5）原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。24试述动物细胞传代培养的方法。根据细胞生长的恃点，传代方法有3种:1、 悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2、 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）：此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3、贴壁生长细胞传代：采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。吸出培养瓶中的培养液，Hank液或PBS洗去残留培养液。加入适量 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-5 min（显微镜下动态监测）；吸去胰蛋白酶液，加入培养液；用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液；计数，接种进行传代培养。25试述动物细胞活力测定的方法和原理。1、台昐蓝染色法：用0.5%的台昐蓝只对死细胞着色，而测定活细胞数和计算存活百分率。死细胞能被台昐蓝染上色，镜下可见深蓝色细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。测定活力的同时可以完毕计数。2、MTT法：活细胞中琥珀酸脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨，并沉淀在细胞内和细胞周边中。甲暨结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。此法简朴快速，准确，广泛用于新药筛选、细胞毒性实验、肿瘤放射敏感性实验等方面。但需要注意的是此法只能测定细胞的相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。MTT粉末和溶液都需要避光保存。26动物细胞大规模培养技术有哪些？各有什么优点？一、 悬浮培养技术：少数动物细胞在离体培养时不需附着物，只需悬浮于培养液中就可以良好生长。传代时不需要再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。细胞增殖快、产量高、培养过程简朴，是动物细胞大规模培养的抱负模式。但是，只有很少数种类的细胞适合这种悬浮培养。二、固定化培养技术：动物细胞几乎皆可采用固定化方法培养。优点：1、细胞可维持在较小体积培养液中生长；2、细胞损伤限度低；3、易于更换培养液；4、细胞和培养液易于分离；5、培养液中产物浓度高，简化了产品分离纯化操作。27动物固定化培养技术的种类和各自的重要优点是什么？微载体培养技术：兼有固定化和悬浮培养的双重特点。有较大贴附面积，满足大多数细胞基本规定，载体体积小，比重轻，轻度搅拌即可携带细胞悬浮于培养基内；兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养；细胞所处环境均一，放大容易；培养操作可系统化、自动化，减少了污染发生的机会。多孔载体培养：优点：大规模高密度培养；减少血清用量；比表面积大；适合贴壁依赖性/非依赖性细胞的培养。微囊化技术：减少了搅拌对细胞产生的剪切力；产物易于分离；适合贴壁依赖性/非依赖性细胞的培养。中空纤维培养法：1、细胞生长密度高，可达108个/毫升以上；2、营养物质可有效分布，代谢废物可及时排除；3、细胞培养可过数月，易于实现连续培养；4、细胞分泌的蛋白质浓度高，利于减少成本；5、反映器体积小并可用于培养多种细胞（悬浮细胞与粘附型细胞均可）。28在制备单克隆抗体过程中是如何筛选杂交瘤细胞的？其原理是什么？筛选：HAT培养基：融合所用的脾细胞是HGPRT和TK细胞株，能通过补救途径合成DNA，但不能长期生存。融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT/TK-细胞株，在HAT培养中不能合成DNA。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中通过补救途径合成，又能长期存活与繁殖。基本原理是1、通过融合两种细胞而同时保持两者的重要特性。2、这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的重要特性是它的抗体分泌功能但很难在体外培养生长，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，但不难分泌特定的抗体。3、在选择培养基的作用下，只有融合细胞才具有连续增殖的能力，形成同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特性的细胞克隆。29试述单克隆抗体的制备过程A、动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备：一般要通过初次免疫、第二次免疫、加强免疫（向动物静脉内注射）三个过程。取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。、B骨髓瘤细胞的获得与培养：一般在准备融合前两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处在对数生长期且活细胞高于95%。C、细胞融合：将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，用不含血清培养液洗1次，离心。细胞液接种于含20%胎牛血清培养基的96孔培养板中，37、5CO2培养箱培养。D、HAT选择杂交瘤：24小时后改用HAT培养基并维持培养两周，改用HT培养液维持培养三周，改用一般培养液。E、抗体的检测：取上清液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择出抗体高分泌性的杂交瘤细胞。F、杂交瘤细胞的克隆化培养：运用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。G、单克隆抗体的大量生产：1）实体瘤法 ：对数生长期的杂交瘤细胞按接种于小鼠背部皮下，每待肿瘤达成一定大小后则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达成1-10mgml。但采血量有限。2）腹水制备法：将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水3）生物反映器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗：运用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。30试述干细胞的定义、生物学特性和分类。定义：干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。生物学特性：（1）自我更新特性：通过两种方式生长：一种是对称分裂，形成两个相同的干细胞；另一种是非对称分裂，一个保持亲代细胞的特性，另一个走向分化的终端成为功能专一的分化细胞。（2）增殖特性：慢周期性：绝大多数细胞处在G0期。自稳性：通过自我更新维持在自身的数目稳定。（3）分化特性： 可以产生至少一种类型的高度分化的子代细胞。 干细胞的功能为控制和维持细胞的再生。分类：不同的干细胞具有不同的分化潜能。从所具有的分化功能上讲，干细胞可分为单能干细胞、多能干细胞与全能干细胞。历来源上讲，干细胞涉及成体干细胞和胚胎干细胞。 31试比较胚胎干细胞与成体干细胞的异同。同：成体干细胞与胚胎干细胞同样，都可在体外进行自我更新，并且在适宜的条件下，均可分化成为具有特殊形态和特定功能的子代细胞。异：来源：胚胎干细胞：1、囊胚期胚胎的内细胞团(ES细胞)（重要途径）； 2、原始生殖细胞(EG细胞) ；3、体细胞克隆内细胞团(ES细胞) ； 4、胚胎瘤细胞(EC细胞)。成体干细胞：多来自于成体的各种组织。胚胎干细胞分离、纯化都比较容易进行，而成体组织中干细胞的数量很少，分离、纯化相对困难得多。分化潜能：胚胎干细胞要较成体于细胞宽，胚胎干细胞具有多能性，单个的胚胎干细胞通过体外增殖，分化后可形成体内许多种细胞；而成体干细胞多为多为单胚层多能干细胞，尽管成体干细胞具有可塑性，但通常只能分化形成某一特定组织的细胞类型。端粒酶的活性不同：胚胎干细胞端粒酶活性高，具有长的端粒。在体外不断增殖且维持遗传的稳定性（正常的核型及端粒的长度）。成体干细胞端粒酶活性低，具有短的端粒。32在制备转基因动物时，外源目的基因导入各有哪些方法？各自的特点是什么？（1）原核期胚胎基因显微注射法：通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵。特点：用显微注射方法制备转基因动物，操作技术性很强，即使是受过严格训练的专业人员，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5%，一般情况下，通过微注射法获得转基因动物的成功率只有1/1000.（2）胚胎干细胞移植法：将对的整合的转基因ES细胞培养后进行核移植或注射到处在胚泡期的供体胚胎，将胚胎移植到代母的子宫内。特点：转基因的效率高（3）精子载体导入法：外源目的基因导入精子。可通过DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法等方法实现。被导入外源目的基因的精子与卵子受精。方法有人工授精、壶腹部手术授精、体外授精等。最终获得转基因动物。特点：经济、方便、转染率高。（4）反转录病毒感染法：将含目的基因的反转录病毒载体人为感染初期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再通过杂交、筛选即可获得转基因动物。特点：基因转移效率、感染率、整合率明显高于其他基因转移方法。但不能完全杜绝反转录病毒在转基因动物生产的商品中的污染。（5）卵母细胞显微注射法：将带有外源目的基因的缺陷型反转录病毒通过显微注射技术注入卵母细胞的卵周腔，通过体外受精，胚胎移植获得基因动物。优点：适合制备大型转基因动物；避免产生嵌合体动物；提高外源基因与核染色体接触的机会；提高外源基因的整合率。33试述转基因动物技术的应用。1、 研究基因的结构和功能及其表达与调控。2、 转基因动物模型与基因治疗。3、 优良动物的育种：通过转基因可获得生长快速、品质良好、抗病力强、产量高的动物品种。4、 在医药领域：通过相应转入目的基因的动物获得所需的药物。5、在异种器官移植中，通过转基因技术以期获得人类所需的不被免疫排斥的器官。34组织工程重要研究内容、面临的挑战和制约是什么？研究内容有四个方面：种子细胞、支架材料、适合构建的组织和器官的细胞因子、组织工程的临床应用。面临的挑战与制约：1、可靠的细胞来源以及实现移植细胞的产业化：动物细胞易于引起免疫反映并也许携带人畜共患病毒；人类细胞是首选，但原代培养人体细胞增殖能力有限，难以作为产业化的。可靠细胞来源：人的胚胎干细胞：能在体外无限增殖但ES细胞的体内移植也许有致肿瘤的隐患；作为异体细胞存在抗原性问题；使ES细胞分化为目的细胞的研究刚刚起步。从组织中分离出所谓的前驱细胞：更为现实的可靠来源。2、 研制具有完全仿生的人工细胞外基质支架材料。研制具有细胞外基质功能的可被生物降解且不产生瘢痕组织的支架材料是组织工程产业化的前提和保证。应当具有良好的组织相容性；良好的表面活性；具有可塑性；生物可降解性；具有三维立体结构。3、 按照组织部件工厂的规定，进行组织工程化产品体外哺育条件的优化。目前在常规实验条件下，进行组织工程化产品的体外哺育还存在许多问题：如细胞数量太少；不能及时更换培养液和代谢产物；不能为细胞生长提供类似体内的特殊生长环境。4、 大体积组织或器官构建的血运难题。目前已经取得明显进展的组织工程研究领域，重要集中在人工皮肤、软骨、血管等，这些组织较薄，故不存在血运障碍的困扰。但对大体积的器官和组织特别是胰、肝、肾等需要大量血液供应的器官，诱导血管的生长是关健之一。须探索生长因子释放和活性的控制，以便只在需要的时候及需要的位置形成血管。5、建立组织工程产品的质量控制体系，保证其临床应用的安全性和可行性。需及时制定切实可行的质量控制标准以对产品进行评价，制定国家行政主管部门对组织工程产品的审批程序。