利用液相色谱一大气压化学电离源一质谱分析活性污泥中的微生物呼吸醒.pdf

上编研究报告，.7 s利用液相色谱一 大气压化学电离源一 质谱分析 活性污泥中的微生物呼吸醒 张星 高孟吞，杨敏，胡建英“(1 中科院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室，北京 1 0 0 0 8 5;2 北京大学环境学院，北京 1 0 0 8 7 1)摘要 本文建立了一种简便、快速和高灵敏度的液相色潜一 大气压化学离子源一 质谱联用(L C-A P C I-M S)微生物呼吸酿的测定方法.粗提和纯化过的样品通过S e p-P a k P l u s 固相萃取分离.每一种酸通过异丙醚一 甲 醉(1 7:8 3,v/v)作为流动相的O D S 分析柱完全分离.利用保留时间、U V光谱和质谱在没有任何标样的情况下可以确认泛酪和甲基蔡陇的成分.利用L C-A P C I-MS 负离子棋式，仪器检测限可降至p g/L 量级。对L C-U V,L C-A P C I-M S 和L C-E S I-M S正离子和负离子模式进行了比 较。该方法能够广泛用于活 性污泥和生物膜等生物过程及其他水环境过程的徽生物种群分析。*a;e l.9v T Ni r f s甲4SO L C-AP C I-MSI d e n t i f i c a t i o n o f I s o p r e n o i d Q u i n o n e s i n t h e A c t i v a t e dS l u d g e b y L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y-Ma s s S p e c t r o m e t r y U s i n g A t mo s p h e r i c P r e s s C h e mi c a l I o n i z a t i o n Z H A N G Y u G A O Me n g c h u n Y A N G Mi n H U J i a n y i n g (1 S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f E n v i r o n m e n t a l A q u a t i c C h e m i s t r y,R e s e a r c h C e n t e r f o r E c o-E n v i r o n m e n t a lS c i e n c e s C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s,1 0 0 0 8 5;2 C o l l e g e o f E n v i r o n m e n t,B e i j i n g U n i v e r s i t y,B e i j i n g 1 0 0 8 7 1)A b s t r a c t;A n e a s y,r a p i d a n d s e n s i t i v e a n a l y t i c a l m e t h o d w a s d e v e l o p e d f o r.t h e i d e n t i f i c a t i o n o fm ic r o b ia l is o p r e n o id q u i n in e s u s in g l iq u id c h r o m a t o g r a p h y-a t m o s p h e r i c p r e s s u r e c h e m ic a l io n iz a-t i o n m a s s s p e c t r o m e t r y(L C-A P C I-MS).E x t r a c t i o n a n d c l e a n u p o f s a m p l e s w e r e p e r f o r m e d o nS e p-P a k P l u s S i l i c a s o l i d p h a s e e x t r a c t i o n c a r t r i d g e s.C o m p l e t e s e p a r a t i o n a m o n g e a c h i n d i v i d u a lq u i n o n e s w a s a c h i e v e d o n a n O D S a n a l y t i c a l c o l u m n w i t h i s o p r o p y l e t h e r-*m e t h a n o l(1 7，8 3,v/v)a s m o b i l e p h a s e s.T h e c o m p o s it i o n s o f u b i q u i n o n e a n d m e n a q u in o n e w e r e d e t e r m in e d d i r e c t l y u s-i n g c o m b i n e d i n f o r m a t i o n o f r e t e n t i o n t i m e,U V s p e c t r u m a n d m a s s s p e c t r u m w i t h o u t a n y s t a n-d a r d s a m p le s.T h e i n s t r u m e n t d e t e c t i o n l i m i t s c o u l d b e d o w n t o a p g/L l e v e l i n a c e t o n e s o l u t io nu s i n g L C-A P C I-M S o f n e g a t iv e m o d e.D if f e r e n t m e t h o d s,in c l u d in g L C-U V,L C-A P C I-M S a n dL C-E S I-MS w i t h n e g a t i v e a n d p o s i t i v e m o d e s w e r e c o m p a r e d.T h i s m e t h o d c o u l d b e w i d e l y a p-p l ie d f o r t h e c h e m o t a x o n o m y o f m ic r o o r g a n is m s in a c t i v a t e d s l u d g e a n d b io-f i l m in b i o l o g ic a l p r o-c e s s e s a n d o t h e r a q u a t i c e n v i r o n m e n t.K e y w o r d s,A c t i v a t e d s l u d g e,U b i q u i n o n e,M e n i q u i n o n e,L C-A P C I-MS 7 6微生物生态学研究进展第五届微生物生态学术研讨会论文集微生物呼吸醒作为微生物呼吸链中电子载体必不可少的组成部分生物。一般来说，一个物种或属只有一种占主导地位的呼吸醒，一 5 如图几乎存在于所有的微 所示为两类主要的醒:泛醒和甲基蔡醒 带有类异戊二烯侧链的微生物醒通常是将环境样品经柱层析、薄层色谱(T L C)或固相萃取(S P E)萃取后，可利用高效液相色谱_ UV(光电二极管阵CH,O污长|、CH,O泛砚F U Q一n(H x)甲准蔡醛 MK一、(H.门图 1 泛I ft 和甲基蔡酿的结构列检测器)测定 比，。泛醒和甲 基蔡酿虽然能够用 上述方 法分离，但是由 于酿的种类较多.标准样品无法得到。此外，L C-U V难以解决环境样品基底杂质干扰的问题，造成方法的 选择性不高。质谱检测器是一种高灵敏度、高选择性的功能强大的检测系统。有报道利用f r i t-F A B-L C-MS(f r i t-F A B l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y-m a s s s p e c t r o m e t r y w i t h d y n a m i c f a s t a t o m b o m-b a r d m e n t)方法检测纯培养的带异戊二烯侧链的微生物醒。然而，该方法的检测限不能满足环境微生物分析的要求C z.e l。为了解决环境微生物酿的分析问题，本文建立了一种 方便、高灵敏的L C-A P C I-MS方法1 材料与方法1.1 标准溶液和试剂 标准样品U Q-6,U Q-1 0 及V i t a m i n K 1 均购自 美国S i g m a 化学公司。1 0 0 0 m g/L的标准储备液采用丙酮配制，并在4 0 C 保存。化合物的标准使用液是将标准储备液用丙酮稀释制得的，并在相同条件下保存。超纯水(电阻率，1 8.l d 1/c m)是由 美国F i s h e r 公司制造的E a s y p u r e小型超纯水机制备。甲醇、异丙醚、丙酮、己烷等均为H P L C级(美国F i s h e r 公司生产)。三氯甲烷、无水甲醇、乙醚均为分析纯级(北京化工厂生产)。S e p-P a k(r)P l u s 硅胶固 相萃取柱(内 径:1 o m m;长度:2 0 m m;装填硅胶量:6 0 0 m g;硅胶粒径:5 5-1 0 5 p m;美国w a t e r s 公司制造)。1.2 样品采集 活性污泥的样品于2 0 0 2 年6 月采自 北京高碑店污水处理厂的曝气池。样品采集后置于塑料瓶中，经l h 固相萃取预处理后备用。1.3 样品前处理活性污泥的萃取方法见 文献C z 7 酿首先经氯仿一 甲 醇混合液粗提，然后经正己 烷纯化。粗提物中带异戊二烯侧链的醒通过S e p-P a k p l u s 硅胶柱分离。1.4 液相色谱 液相色谱实验是在Wa t e r s A l l i a n c e 2 6 9 0(Wa t e r s C o r p o r a t i o n,U S A)液相色谱上进行的，色谱配制为四元梯度泵，1 0 0 川进样环自 动进样器，反相柱(Z o r b a x-O D S,4.6 m m i n 1.D X2 5 0 m m,A g i l l e n t C o.U S A)和光电二极管阵列检测器。甲 醇 一 异丙醚(8 3:1 7,v/v)为流动相，上编研究报告7 7 流速0.8 m 1/m i n,1.5 质谱 Wa t e r s 联用M i c r o m a s s Z M D四极杆质谱仪(Mi c r o m a s s,M a n c h e s t e r,U.K)，质谱仪采用Z-喷雾离子源配备空气大气压探测器。L C的全部柱留出物可通过直角Z-喷雾界面直接进入离子源，使得灵敏度增强。质谱条件通过直接进样优化.在负离子和正离子模式下，典型的离子源参数如下:A P C I 毛细管电压3.AV;锥孔电压4 5 V;源温度1 5 0 0 C;A P C I 质谱温度3 5 0 0 C;锥孔气流量4 0 0 L/h;脱溶剂气流量3 0 0 L/h,1.6 定性和定A分析 醒的定性分析采用质谱和U V光谱的全扫描模式，确定了Q-6,Q-1 0 和V i t a m i n K 1仪器检测限。Q-6,Q-1 0 和V i t a m i n K 1 的最小仪器检测限是在S I M模式下分别通过噪音信号估算出来的。2 结果与讨论2.1 混标分析结果 图 2(a)和(b)分别是利用负离子和正离子模式的大气压化学电离源(A P C I)方法分析的Q-6 的质谱图。在质谱分析中，Q-6 在正离子模式下的准分子离子峰 M+2 3 十 在m/z 为6 1 4 处出现，而与常规的负离子模式下的准分子离子峰相反，Q-6 本身的 M 一 在，/z 为5 9 1处出现，这些结果均与Q-6 的弱极性相关。图3(a)和(b)分别是利用负离子和正离子模式下A P C I 方法分析的，Q-6,Q-1 0 和V it a m i n K 1 混标溶液的总离子流质谱图。如图3 所示，Q-6,Q-1 0 和V i t a m i n K 1 在负离子模式下的响应强度明显高于正离子模式。这就表明，A P C I 技术在负离子模式下检测微生物醒的灵敏度远高于正离子模式。另一方面，实验表明L C-E S I(电喷雾电离源)-MS 在正、负离子模式下的灵敏度远低于L C-A P C I-M S 方法。Q-6,Q-1 0 a n d V K-1 最低仪器检测限分别为2 0,2 0 0 和 6 1,g/L。本方法的检测限比先前报道的f r i t-F A B-L C-MS 方法有很大的提高。2.2 微生物分析 本研究中建立的L C-A P C I-MS方法能够应用于环境样品中微生物酿的检测。泛醒U V光谱在2 7 5 n m有一个最大吸收，甲基蔡醒的z-x 则为2 7 0 n m。特定的U V光谱有助于准确地鉴别泛醒和甲 基蔡酿。活性污泥中醒的 分析结果如图4 所示口 在高碑店污水处理厂的活性污泥中酿的总离子流图中发现了1 1 异戊二烯侧链的醒。U V光谱和质谱碎片 M 一 在，/z 为5 9 1,6 5 9,7 2 7,7 9 5 和8 6 3 处的结果表明，其中五个峰分别被确认为Q-6,Q-7,Q-8,Q-9 和Q-1 0。其 余6 个峰从U V光谱分析被确认为甲 基禁醒，分子离子仁 M 一 在m/z 为5 8 1,6 4 8,7 1 7,7 1 9,7 2 1 和7 8 5 处的碎片离子表明，六类甲基蔡酿分别为MK-6,MK-7,MK-8,MK-8(H i),MK-8(H 4)和MK-9,MK-8(H 2)或MK-8(H 4)的异戊二烯侧链有一个或两个加氢的双键。2.3 结论 本文建立了一种高灵敏度、选择性和重现性的L C-A P C I-MS 方法用于环境样品泛酿和甲 7 8 微生物生态学研究进展第五届微生物生态学术研讨会论文集1 0 0%5 9 1.0 2一/一。:.。E Ml5 93.0 902 0 0_ 以-，_ _ 一_ _4 0 0-一-5 7 6.0 45 7 4.0 8 _6 1 4.0 01 0 0 VI(b)F M+2 3 61 5.055 9 2.012 02 0 05 7 3.9 861 6.0 661 7.1 1.，叫 御 叫，.目 户，.，一-图2 Q-6 的L C-A P C I-M S质谱图负离子模式(。)和正离子棋式(b)基蔡醒的分析。这一技术克服了H P L C-U V和F R I T-F A B L C-MS 等传统方法的缺点。2 z0 0 6本文的分析方法可在没有任何标样的情况下通过U V光谱和质谱碎片分析带异戊二烯侧链的酿。这一技术为环境样品微生物群落分析提供了一种强有力的工具。参 考 文 献 1 H u H Y,L im B R,G o t o N,B h u p a t h i r a j u V K,F u j ie K.C h a r a c t e r iz a t io n o f m ic r o b ia l c o m m u n it y i n a n a c t i v a t e d s l u d g e p r o c e s s t r e a t i n g d o m e s t i c w a s t e w a t e r u s i n g q u i n o n e p r o f i l e s.Wa t e r S c i T e c h,2 0 0 1,4 3:9 9-1 0 6 2 H u H Y,F u j i e K,U r a n o K.D e v l o p m e n t o f a n o v e l s o l i d p h a s e e x t r a c t i o n m e t h o d f o r t h e a n a l y s i s o f b a c t e r ia l q u i n o n e s i n a c t i v a t e d s l u d g e w i t h a h ig h e r r e l ia b i l i t y.J B io s c ie n c e 色B io e n g i n e e r i n g,1 9 9 9,8 7:3 7 8-3 82 3 H ir a is h i A,G e n J.R e s p i r a t o r y q u i n o n e p r o f i le s a s t o o l s f o r id e n t i f y i n g d i f f e r e n t b a c t e r ia l p o p u l a t io n s i n a c t i v a t e d s l u d g e.A D D I Mi c r o b i a l,1 9 8 8,3 4:3 9-5 6上编研究报告7 9.()Q-6VK一 IQ-1 01.阳门川曰曰曰曰日川日日曰1 0 1-10 0%红.2 4 4 x 6Q-6VK-1TI C 3.4 0 6一Q-1 0匕一_ _ _ 八_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _一一1.一 一 一5.0 0 图 31 5.0 02 5.0 06r1 1A3 5.0 04 5.0 0Q-6(1 0 m g/L),Q-1 0(1 0 m g/L)和V K-1(I O m g/L)混标的L C-A P C I-MS色谱图负离子棋式 a)和正离子模式(b)I J O Q 一RQ-工 0M K一 7Q-7 M K-6M K一 8Q一 9Q 一6MK一8(H,)MK一8(H,)05.0 01 5.0 02 5.0 03 5.0 门M K-9n s.r 0时la)图4 MW T P 活性污泥中 泛暇和甲 基蔚酸的L C-A P C I-M S(N I)色谱图 4 C o l l i n s M D,J o n e s D.D is t r i b u t io n o f i s o p r e n o id q u in o n e s t r u c t u r a l t y p e s i n b a c t e r i a a n d t h e i r t a x o n o m i c i m p l i c a t i o n s.Mi c r o b i o l R e v,1 9 8 1,4 5;3 1 6-3 5 4 5 T a m a o k a J,K a t a y a m a F Y,K u r a is h i H.A n a l y s i s o f b a c t e r ia l m e n a q u i n o n e m i x t u r e s b y h ig h p e r f o r m a n c e l iq u id c h r o m a t o g r a p h y.J A p p l B a r t e r i o l,1 9 8 3,5 4:3 1-3 6 6 I t o Y,T a k e u c h i T,I s h i i D.D i r e c t c o u p l in g o f m ic r o h ig h 一 p e r f o r m a n c e l iq u id c h r o m a t o g r a p h y w it h f a s ta t o m b o m b a r d m e n t m a s s s p e c t r o m e t r y.J C h r o m a t o g r,仁 8 Mi y u k i N i s h i j i m a,Mi h o A r a k i 一s a k a i,H i r o s h i S a n o1 9 8 5.3 4 6:1 6 1-1 6 6I d e n t i f i c a t i o n o f i s o p r e n o i d q u i n o n e sl i q u i d c h r o m a t o g r a p h y 一m a s s s p e c t r o m e t r y f o r t h e c h e m o t a x o n o m y o f m i c r o o r g a n i s m sMe t h o d s,1 9 9 7,2 8:1 1 3-1 2 2b y f r i t-F A BJ Mi c r o b i o l