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化学毕业论文 女贞树根中黄酮提取及其清除羟基自由基初探

目录

摘要 Ⅰ
关键词 Ⅰ
Abstract Ⅱ
Keywords Ⅱ
前言 1
1 实验材料、试剂及仪器 2
1.1 实验材料 2
1.2仪器 2
1.3 试剂 2
2 实验方法 2
2.1女贞树根的采集与预处理 2
2.2 女贞树根黄酮的提取及其定性检验 2
2.2.1女贞树根黄酮的提取..............................................................3
2.2.2提取液的定性检验................................................................3
2.3芦丁标准溶液的配制和标准曲线的绘制............................................... 3
2.3.1芦丁标准溶液的配制..............................................................3
2.3.2测定方法依据................................................................... 3
2.3.3芦丁标准溶液最大吸收波长的测定................................................ .3
2.3.4芦丁标准曲线的绘制..............................................................3
2.4 单因素实验 3
2.4.1乙醇浓度的选择 3
2.4.2 料液比的选择 4
2.4.3 回流提取温度的选择 4
2.4.4 回流提取时间的选择 4
2.5 正交实验 4
2.6比较提取液、芦丁溶液、BHT溶液对羟基自由基的清除 4
3.实验结果与分析 5
3.1 女贞根黄酮提取液的定性检验 5
3.2 芦丁和女贞根黄酮提取液最大吸收波长的测定 5
3.3 标准曲线的绘制及其线性回归方程 5
3.4单因素实验 5
3.4.1乙醇浓度的选择 6
3.4.2 料液比的选择 7
3.4.3 回流提取温度的选择 8
3.4.4 回流提取时间的选择 9
3.5 正交实验 9
3.6比较提取液、芦丁溶液、BHT溶液对羟基自由基的清除 10
4.结论..............................................................................11参考文献 12
致谢 13

女贞树根中黄酮提取及其清除羟基自由基初探

摘要：采用乙醇回流法提取女贞树根中的黄酮，以乙醇浓度、提取温度、提取时间、液料比为考察因素，对女贞树根黄酮的提取工艺进行单因素及正交实验，并探究了提取液清除羟基自由基。结果表明，乙醇回流法提取女贞树根中黄酮的最佳条件为：乙醇浓度70%，温度75℃，料液比1:15（g/mL），提取时间2.5h，此条件下黄酮提取得率为3.32%。同体积不同浓度的女贞根黄酮提取液与芦丁溶液和BHT溶液清除羟基自由基的能力，在70～200ug/mL浓度范围内，强弱顺序为芦丁溶液＞女贞根黄酮提取液＞BHT溶液，表明在70～200ug/mL浓度范围内，女贞根黄酮提取液能较好的清除羟基自由基。
关键词：女贞树根；黄酮；提取；清除羟基自由基

Flavonoids and their scavenging of privet roots

Abstract: The flavonoids in the ethanol reflux method to extract privet roots, ethanol concentration, extraction temperature, extraction time, liquid feed ratio for the investigated factors privet roots flavonoids extraction process of a single factor and orthogonal experiments, andexplore extract Clear the hydroxyl radical. The results showed that the extract privet roots, ethanol reflux method flavonoids: 70% of the ethanol concentration, temperature 75 ° C, the solid-liquid ratio of 1:15 (g / mL), extraction time 2.5 h, flavonoids mentioned under this condition achieved was 3.32%. The same size but different concentrations of privet root flavonoid extract and rutin solution and BHT solution to remove the ability of the hydroxyl radical, 70 ~ 200ug/mL concentration range, the strength of the order of rutin solution privet root flavonoids extract> BHT solution, indicating that at 70 200ug/mL concentration range, the privet root flavonoid extract better scavenging.
Keywords: privet roots; flavonoids; extract; scavenging

II
女贞树根中黄酮提取及其清除羟基自由基初探
前 言
黄酮类化合物（flavonoes compounds）泛指两个苯环(A与B)通过三个碳原子相互联结而成的一系列化合物[1] 。黄酮类化合物广泛存在于植物中,而且生理活性多种多样,在花、叶、果等组织中,一般多以苷的形式存在[2]。黄酮类化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化，抗衰老，抗菌，抗肿瘤等，此外，黄酮类化合物还具有降压、降血脂﹑增加冠脉流量、强心、抗心律不齐等药理作用[3]。
女贞（L igu strum lucidum）是木犀科女贞属常绿乔木, 广泛分布于亚洲国家。查阅相关资料，知目前提取黄酮的方法有水提法﹑有机溶剂提取法﹑碱性水或碱性稀醇提取法﹑微波提取法﹑超声波提取法﹑酶解法﹑超临界流体萃取法﹑双水相萃取分离法[4]。有研究表明用乙醇水溶液提取女贞子中的黄酮，浸出率高, 且能够回收乙醇,极大降低了成本[5]。故本实验采用乙醇水溶液提取女贞根中黄酮含量的提取。刘晓庚等对女贞果实进行了抗氧化性研究[6]，但对女贞根中黄酮类化合物的提取及清除羟基自由基研究尚未有报道，为了充分利用女贞资源，本论文从两方面进行探究：一通过单因素及正交实验，确定最佳提取条件；二初步探究女贞根黄酮提取液清除羟基自由基的能力，为进一步开发和利用作一些参考。

1实验材料、试剂及仪器
1.1 实验材料
女贞树根（采集于楚雄师院老校区实验室后）
1.2仪器
仪器：722-S型可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；HH-S2S恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）；CP214C电子天平（奥豪斯仪器有限公司制造）； SHZ-ⅢA型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；新型密封式粉碎机（广州市大祥电子机械设备有限公司）；回流冷凝装置。
1.3试剂
芦丁（USP）、BHT、无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、三氯化铁、三氯化铝、浓盐酸、锌粉、水杨酸、过氧化氢（30%）（以上均为国产分析纯），实验室自制的蒸馏水和超纯水。
2实验方法
2.1女贞树根的采集与预处理
女贞根→洗净→晒干→粉碎
2.2女贞树根黄酮的提取及其定性检验
2.2.1女贞树中根黄酮的提取
称取3.0g女贞根粉置于100mL的圆底烧瓶中，加入60mL70%的乙醇溶液，在80℃的恒温水浴锅中回流2h，过滤，用70%的乙醇溶液反复洗涤圆底烧瓶，将滤液定容至100.00mL，制得提取液。
2.2.2提取液的定性检验
（1）盐酸—镁粉反应：取1.0mL提取液于试管中加适量镁粉摇匀，再加入浓盐酸5滴，观察其泡沫颜色。若提取液中含有黄酮类化合物，则显橙红色[7]。
（2）三氯化铝反应：用胶头滴管滴3滴提取液在滤纸上，滴加2滴1%的三氯化铝乙醇溶液，观察颜色变化。若提取液中含有黄酮类化合物，则显黄色[7]。
（3）三氯化铁反应：用胶头滴管滴3滴提取液在白色点滴板上，加2滴1%的三氯化铁乙醇溶液，观察颜色变化。若提取液中含有黄酮类化合物，则显墨绿色[7]。
（4）氢氧化钠反应：用胶头滴管滴3滴提取液在滤纸上，滴加2滴4%的氢氧化钠溶液，观察颜色变化。若提取液中含有黄酮类化合物，则显黄色[7]。
2.3芦丁标准溶液的配制和标准曲线的绘制
2.3.1芦丁标准溶液的配制
将芦丁置于干燥箱中，在120℃下干燥1.5h，冷却后准确称取芦丁标准品10mg，用70%的乙醇溶液溶解，并定容至50.00mL,制得浓度为0.20mg/mL的芦丁溶液。
2.3.2测定方法依据
以芦丁标准液为对照品测定女贞树根中总黄酮的提取得率，黄酮与Al3+进行络合反应，在碱性条件形成络合物[8]，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰，吸光度值与黄酮浓度服从朗伯—比尔定律，可通过比色法进行测量[9]。
2.3.3芦丁标准溶液最大吸收波长的选择
用移液管精确移取芦丁标准溶液0.50mL,置于25.00mL的比色管中，加入0.30mL 5%的亚硝酸钠溶液,混匀，放置6min；再加入0.30mL 10%的硝酸铝溶液，混匀，放置6min；再加入4.00mL 4%的氢氧化钠溶液，混匀，放置6min；再用浓度为70%的乙醇定容至10.00mL，摇匀，放置6min后，以试剂空白做参比，在450～570nm的波长范围内，每隔10nm测定吸光度,确定最大吸收波长（此后的吸光度均在该波长下测定）。用同样的方法测定女贞根黄酮提取液的吸光度。
2.3.4芦丁标准曲线的绘制
精确吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50﹑3.00 mL于7支25.00mL的比色管中，显色方法同2.3.3，在波长为510nm处测定吸光度（以第一支为空白溶液）。以芦丁溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2.4单因素实验
2.4.1乙醇浓度的选择
各称取3.0g女贞根粉置于5个100mL的圆底烧瓶中，分别加入60mL不同浓度的乙醇溶液，在80℃的恒温水浴锅中回流2h，过滤，用相应浓度的乙醇溶液反复洗涤圆底烧瓶，滤液定容至100.00mL。然后用移液管精确移取女贞根黄酮提取溶液0.50ml,置于25.00mL的比色管中，显色方法同2.3.3，在波长为510nm处测定吸光度，平行实验三组。再把吸光度值带入芦丁标准曲线的线性回归方程，计算出提取液的黄酮浓度。最后计算出女贞树根总黄酮提取得率。
总黄酮提取得率的计算公式：
提取得率＝（C×n×V）／m×100%
其中：C为稀释以后提取液的浓度(mg/mL)，n为稀释倍数，V为提取液定溶后的体积(mL)，m为样品质量（mg）。
2.4.2料液比的选择
各称取5份不同质量的女贞根粉置于5个100mL的圆底烧瓶中，分别加入60mL70%的乙醇溶液在，80℃的恒温水浴锅中回流2h，提取液的处理方法同2.4.1，显色方法同2.3.3，在波长为510nm处测定其吸光度，平行实验三组，最后计算出女贞树根总黄酮提取得率。
2.4.3回流提取温度的选择
称取3.0g女贞树根粉置于5个100mL的圆底烧瓶中圆底烧瓶中，分别加入60mL70%的乙醇溶液在不同温度下恒温提取2h,提取液的处理方法同2.4.1，显色方法同2.3.3，在波长为510nm处测定其吸光度，平行实验三组，最后计算出女贞树根总黄酮提取得率。
2.4.4回流提取时间的选择
称取3.0g女贞树皮粉置于5个100mL的圆底烧瓶中圆底烧瓶中圆底烧瓶中，分别加入60mL70%的乙醇溶液，在80℃的恒温水浴锅中回流不同的时间，提取液的处理方法同2.4.1，显色方法同2.3.3，在波长为510nm处测定其吸光度，平行实验三组，最后计算出女贞树根总黄酮提取得率。
2.5正交试验（四水平三因素）
在单因素实验基础上，进行L9（34）正交实验，确定最佳提取条件。
2.6比较提取液、芦丁溶液、BHT溶液对羟基自由基的清除
参照Fenton反应的方法建立反应体系模型。利用H2O2与亚铁离子反应生成·OH自由基，即Fe2++ H2O2→Fe3++·OH+OH-，由于自由基一般存活时间比较短，而且具有较高活性的特点，水杨酸能有效的捕捉OH ·自由基且产生有色产物〔10〕，该产物在波长为510nm处有强吸收，若加入具有清除·OH功能的黄酮类化合物时，黄酮类化合物便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物生成量减少〔11〕。采用固定反应时间法，在波长为510nm处测量含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，通过计算便能得出被测物对·OH的清除率。
反应体系为：在10mL比色管中加入2.00mL 9mmol/L的FeSO4溶液，2.00mL 9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，2.00mL 8.8mmol/L的H2O2启动反应，最后分别加入1.00mL不同浓度的的提取液，加蒸馏水定容，让反应体系在37℃的水浴中反应30min，以蒸馏水为参比，以试剂空白作比较，在510nm处测定吸光度，考虑到提取液本身的吸光度，在10mL比色管中加入2.00mL 9mmol/L的FeSO4溶液，2.00mL 9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，不同浓度的提取液，加蒸馏水定容，让反应体系在37℃的水浴中反应30min,作为提取液的本底吸收。均重复实验三次，以1.00mL不同浓度的芦丁溶液和BHT（二丁基羟基甲苯）溶液作为对照，比较清除羟自由基的能力。
清除率计算公式:
·OH清除率/%=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%
式中：A0为空白对照溶液吸光度；Ax为提取液吸光度；Ax0为不加H2O2提取液的本底吸光度。
3实验结果与分析
3.1女贞根黄酮提取液的定性检验
按2.2.2所述的内容进行实验，结果如表3-1所示：
表3-1女贞根黄酮提取液的定性检验结果
反应 盐酸—镁粉反应 三氯化铝反应 三氯化铁反应 氢氧化钠反应
现象 橙红色 淡黄色 墨绿色 淡黄色
表3-1中女贞根提取液与各物质反应产生的现象和黄酮类化合物与这些物质反应产生的现象相吻合，表明女贞根提取液中含有黄酮类化合物。
3.2芦丁标准液和女贞根黄酮提取液最大吸收波长的测定
按2.3.3所述的内容进行实验，测定的吸光度结果如图3-1所示：

图3-1芦丁和女贞根黄酮的吸收曲线
从图3-1可看出，芦丁溶液和女贞根黄酮提取液在波长为510nm处有最大吸收峰，故选择510nm为最大吸收波长，此后吸光度均在该波长下测定。
3.3芦丁标准曲线及其线性回归方程
按2.3.4所述的内容进行实验，在510nm处测定其结果如表3-2所示：

表3-2芦丁浓度与吸光度的关系
浓度C（mg/mL） 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
吸光度A 0.00 0.109 0.218 0.325 0.443 0.561 0.666
以表3-2中芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制得的标准曲线如图3-2所示：

图3-2芦丁标准曲线
根据标准曲线得线性回归方程：A= 11.16786 C -0.00332，相关系数R = 0.99986，结果表明，芦丁溶液在0.00 ～ 0.06 mg／mL范围内，吸光度与质量浓度呈良好的线性关系。
3.4单因素实验
3.4.1乙醇浓度的选择
按2.4.1所述内容进行实验，在510nm处测不同浓度的乙醇提取女贞根中总黄酮，其提取得率如图3-3所示：

图3-3乙醇浓度与吸光度的关系
由图3-3可以看出，当其他影响因素一定的条件下，女贞根中黄酮提取得率随乙醇浓度的增大而增大，当乙醇浓度到达70%时提取得率最大，此后随着乙醇浓度的增大，女贞根中总黄酮提取得率反而减小。这主要是由黄酮类物质的相对极性决定的，黄酮类化合物一般具有酚羟基和糖苷链，有一定的极性和亲水性，用较大极性的溶剂提取效果较好。另外，大量的水有效地膨胀了女贞根组织，增大了溶质与溶剂的接触面积，降低了溶剂的黏度，加速了溶质的扩散。当乙醇体积分数超过70％ 时，高浓度的乙醇反而会导致女贞根细胞膜性状改变而使得总黄酮难以从细胞中提出，从而导致黄酮提取得率降低[12]。选择浓度为70%的乙醇为宜。
3.4.2料液比的选择
按2.4.2所述内容进行实验，在510nm处测不同料液比提取女贞根中总黄酮，其提取得率如图3-4所示：

图3-4料液比与吸光度的关系
由图3-4可以看出，当其他影响因素一定的条件下，女贞树根总黄酮提取得率随料液比的增大而增大，当料液比达到1:20（mg/mL）时提取得率最大，此后提取得率缓慢减小，这可能是当提取剂的量（60mL）一定的情况下，随和加入的女贞根粉增多，女贞根粉的溶解达到平衡，故此后提取得率逐渐减少。
3.4.3提取温度的选择
按2.4.3所述内容进行实验，在510nm处测不同温度提取女贞树根中总黄酮提取得率，其结果如图3-5所示：

图3-5 提取温度与提取得率的关系
由图3-5可以看出，当其他影响因素一定的条件下，女贞树根总黄酮提取得率随提取温度的升高而增大，当温度达到80℃时提取得率最大，此后随着温度的升高，女贞树根总黄酮提取得率反而减小。这是因为在适当的温度范围内，黄酮类化合物在乙醇中的溶解度随温度的升高而增大，故提取得率增大[13]，但是温度过高，一些蛋白质、糖类等物质大量溶出,导致提取液粘性加大，杂质溶出量增加，从而导致提取率下降 [5]，故选择80℃为回流提取温度较为适宜。
3.4.4回流提取时间的选择
按2.4.4所述内容进行实验，在510nm处测不同回流时间提取女贞树根中总黄酮提取得率如图3-6所示：

图3-6提取时间与提取得率的关系
由图3-6可以看出，当其他影响因素一定的条件下，女贞树根总黄酮提取得率随提取时间的增加而增大，当提取时间达到2.0h时提取得率最大，此后随着时间的延长提取得率反而减小。这可能是由于提取时间过长,造成了部分黄酮糖苷类物质的水解,导致黄酮检出量减少,从而提取率下降[5]，因此选择2.0h的提取时间较为适宜。
3.5正交实验
按2.5所述进行L9(34)正交实验，正交因素水平表如表3-2所示：
表3-2正交因素水平表

水平 A乙醇质量分数（%） B提取温度（℃） C料液比（g/mL ） D提取时间（h）

1 60 65 1:15 1.5
2 70 70 1:20 2.0
3 75 75 1:30 2.5

按L9(34)进行正交实验，所得结果如表3-3所示
表3-3正交实验提取黄酮的结果

序号 A温度（℃） B时间（h） C乙醇浓度（%） D料液比(g/mL) E提取得率（%）

1 75 1.5 60 1:15 2.98

2 75 2.0 70 1:20 3.14

3 75 2.5 80 1:30 2.66

4 80 1.5 70 1:30 2.30

5 80 2.0 80 1:15 2.65

6 80 2.5 60 1:20 2.99

7 85 1.5 80 1:20 2.34

8 85 2.0 60 1:30 2.10

9 85 2.5 70 1:15 3.23
K1 2.927 2.540 2.690 2.953
K2 2.647 2.630 2.890 2.823
K3 2.557 2.960 2.550 2.353
R 0.370 0.420 0.340 0.600

由表3-3可以看出，乙醇回流法提取女贞树根的黄酮中料液比的影响最大，其次是时间，再次是温度，最后是乙醇浓度，最佳提取条件为A1B3C2D1，即温度75℃，提取时间2.5h，乙醇浓度70%,料液比1:15（g/mL）。
在最佳提取条件提取女贞树根中的黄酮，平行测定三次，所得的总黄酮提取得率如表3-4所示：
表3-4最佳提取条件平行测定结果

序号 黄酮提取得率（%） 平均黄酮提取得率（%）

1 3.42
2 3.25 3.32
3 3.28
由表3-4可得在最佳提取条件下提取女贞树根中的黄酮，其提取得率为3.32%。
3.6比较提取液、芦丁、BHT对羟基自由基的清除
按2.6所述内容进行实验，提取液、芦丁、BHT对羟基自由基的清除结果如图3-7所示：

图3-7芦丁，女贞根黄酮提取液，BHT溶液，芦丁溶液对羟基自由基的清除率
由图3-7可以看出，同体积不同浓度的女贞树根提取液与芦丁溶液和BHT溶液，在0～70ug/mL的浓度范围内，清除羟基自由基能力的强弱顺序为芦丁溶液＞BHT溶液＞女贞根黄酮提取液；在70～200ug/mL的浓度范围内，清除羟基自由基能力的强弱顺序为芦丁溶液＞女贞根黄酮提取液＞BHT溶液，表明在此浓度范围内，女贞根黄酮提取液能较好的清除羟基自由基。
4结论
实验研究表明，采用乙醇回流提取女贞树根中的总黄酮，最佳提取条件为：温度75℃，时间2.5h，乙醇浓度70%,料液比1:15（g/mL），在该条件下女贞树根中黄酮的提取得率为3.32%。同体积不同浓度的女贞树根提取液与芦丁溶液和BHT溶液，在70～200ug/mL的浓度范围内，清除羟基自由基能力的强弱顺序为芦丁溶液＞女贞根黄酮提取液＞BHT溶液，表明在此浓度范围内，女贞根黄酮提取液能较好的清除羟基自由基。

参考文献
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致谢
在这次做毕业论文的过程中遇到了很多困难，但是在诸多老师、同学的关心和帮助下，已经成功完成。在此我要感谢系领导的支持，衷心感谢管春平老师的精心指导、解疑和帮助，管老师严谨的治学态度、精益求精的工作作风对我影响深远，在学习生活中不断的鞭策我要时刻严格要求自己，只有高标准的要求才能够进步。感谢宋建梅老师、李会端老师对我的论文给予宝贵的意见，还要感谢王浩华老师、普翠英老师辛苦劳累提供仪器，最后还要感谢同学们对我的支持和鼓励。

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