综合性实验一质粒DNA的小量制备和电泳鉴定.pptx
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1、综合性实验二综合性实验二 质粒质粒DNA小量制备和电泳小量制备和电泳鉴定鉴定一实验目的一实验目的1掌握碱变性裂解法制备质粒掌握碱变性裂解法制备质粒DNA的原理。的原理。2了解质粒了解质粒DNA的性质和用途。的性质和用途。3.掌握掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。4.掌握质粒掌握质粒DNA(闭环和开环构型)的电泳分(闭环和开环构型)的电泳分离鉴定。离鉴定。质粒质粒 plasmid质粒是细菌染色体外的环质粒是细菌染色体外的环形双链形双链DNA分子,能在宿分子,能在宿主细胞内独立自主的进行主细胞内独立自主的进行复制。复制。质粒质粒基因工程中目基因工程中目的基因的运载的
2、基因的运载工具。工具。质粒载体质粒载体大小可从大小可从1kb到到200kb筛选标记筛选标记多克隆位点多克隆位点酶切位点酶切位点复制原点复制原点质粒的特性:质粒的特性:能能独独立立自自主主进进行行复复制。制。细细菌菌内内的的共共生生型型遗遗传因子,能垂直遗传。传因子,能垂直遗传。能能赋赋予予宿宿主主细细胞胞一一些表型。些表型。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。使没有它们也可以正常存活。质粒的应用质粒的应用质粒的特点使质粒成为携带外
3、源基因进入细菌中扩增或表质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物,这种达的重要媒介物,这种基因运载工具基因运载工具在基因工程中具有极在基因工程中具有极广泛的应用价值。广泛的应用价值。大多数来自细菌的质大多数来自细菌的质粒是粒是双链双链、共价闭合共价闭合环状环状的分子,以的分子,以超螺超螺旋形式旋形式存在。存在。Visualization of topoisomers.In this experiment,all DNA molecules have the same number of base pairs but exhibit some range in the d
4、egree of supercoiling.Because supercoiled DNA molecules are more compact than relaxed molecules,they migrate more rapidly during gel electrophoresis.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n琼琼脂脂糖糖是是由由琼琼脂脂分分离离制制备备的的链链状状多多糖糖。其其结结构构单单元元是是D-半半乳乳糖糖和和3.6-脱脱水水-L-半半乳乳糖糖。许许多多琼琼脂脂糖糖链链依依氢氢键键及及其其它它力力的的作作用用使使其其互互相相盘盘绕绕形形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。
5、成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。n因因此此该该凝凝胶胶适适合合于于核核酸酸与与核核蛋蛋白白、免免疫疫复复合合物物的的分分离离、鉴鉴定定及及纯纯化化。在在临临床床生生化化检检验验中中也也常常用于用于LDH、CK等同工酶的检测。等同工酶的检测。影响电泳迁移率的因素:FrictionCharge外加电流、电压分子量 分子形状分子的等电点VoltageCATHODEANODE+-+琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术 在在一一定定浓浓度度的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶介介质质中中,DNA分分子子的的电电泳泳迁迁移移率与其分子量的常用对数成反比;率与其分子量的常用对数成反比;分分
6、子子构构型型也也对对迁迁移移率率有有影影响响,如如共共价价闭闭环环DNA直线直线DNA开环双链开环双链DNA。当当凝凝胶胶浓浓度度太太高高时时,凝凝胶胶孔孔径径变变小小,环环状状DNA(球球形形)不不能能进进入入胶胶中中,相相对对迁迁移移率率为为0,而而同同等等大大小小的的直直线线DNA(刚刚性性棒棒状状)可可以以按按长长轴轴方方向向前前移移,相相对对迁迁移移率率大大于于0。差速离心差速离心DIFFERENTIAL CENTRIFUGATION离心离心离心离心:利用离心机转子利用离心机转子利用离心机转子利用离心机转子高速旋转产生的强大高速旋转产生的强大高速旋转产生的强大高速旋转产生的强大的离心
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