色谱分析.pptx
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1、色谱分析第一章 绪论第二章 经典柱层析第三章 平面色谱法第四章 气相色谱法第五章 高效液相色谱法第六章 其他色谱技术第七章 色谱分析样品处理参考书目(1)傅若农 色谱分析概论(2)达世禄 色谱学导论(3)邹汉法 高效液相色谱法(4)刘虎威 气相色谱方法及应用(5)何丽一 平面色谱方法及应用 第一章 绪论1.1.概述概述 混合物最有效的分离、分析方法混合物最有效的分离、分析方法 俄国植物学家俄国植物学家茨维特茨维特于于19031903年研究年研究植物色素植物色素时使用的时使用的示意示意装置:装置:其中的一相固定不动,称为其中的一相固定不动,称为固定相固定相;另一相是携带试样混合物流过此固定相的流
2、体(气体另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体(气体或液体),称为或液体),称为流动相流动相。色谱法的出现色谱法色谱法 利用混合物中各组分在两相间分配系数的不同利用混合物中各组分在两相间分配系数的不同,当两项作当两项作相对位移时,各组分在两相间经过反复多次的分配平衡,使相对位移时,各组分在两相间经过反复多次的分配平衡,使得各组分被固定相保留的时间不同,从而获得分离(各组分得各组分被固定相保留的时间不同,从而获得分离(各组分按一定次序由固定相中流出)。按一定次序由固定相中流出)。与适当的柱后检测方与适当的柱后检测方法结合,实现混合物中各法结合,实现混合物中各组分的分离与检测。组分的分离与检测。
3、两相及两相的相对运两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础动构成了色谱法的基础色谱法的特点色谱法的特点(1)分离效率高分离效率高 复杂混合物,有机同系物、异构体。手性异构体。(2 2)灵敏度高灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。(3)分析速度快分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。(4 4)应用范围广应用范围广 气相色谱:沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。液相色谱:高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处不足之处:被分离组分的定性较为困难。2.2.色谱法分类色谱法分类 气相色谱(气相色谱(流动相为气体)流动相为气
4、体)液相色谱(液相色谱(流动相为液体)流动相为液体)柱色谱柱色谱 平面色谱平面色谱 吸附色谱吸附色谱 分配色谱分配色谱 离子交换色谱离子交换色谱 排阻色谱排阻色谱 流动相物态流动相物态固定相使用形式固定相使用形式分离过程机制分离过程机制流动相为气体流动相为气体(称为载气)称为载气)固定相为固体吸附剂固定相为固体吸附剂气相色谱气相色谱气固色谱气固色谱气液色谱气液色谱流动相为气体流动相为气体(称为载气)称为载气)固定相为液体固定相为液体流动相为液体流动相为液体(淋洗液)(淋洗液)固定相为固体吸附剂固定相为固体吸附剂。液相色谱液相色谱液固色谱液固色谱液液色谱液液色谱流动相为液体流动相为液体(淋洗液)
5、(淋洗液)固定相为液体固定相为液体按分离柱不同可分为:填充柱色谱和毛细管柱色谱按分离柱不同可分为:填充柱色谱和毛细管柱色谱 第二章 经典柱层析1.吸附的分类 物理吸附(特点:无选择性;吸附与解吸可逆)常用的硅胶、氧化铝为这一类型;应用最广 化学吸附(特点:具有选择性;吸附十分牢固,甚至不可逆)如黄酮等酚酸性化合物被氧化铝吸附、生物碱被硅 胶的吸附;应用较少 半化学吸附(介于上述之间,如聚酰胺对黄酮、酚类、醌类的 氢键吸附)有一定应用2.极性及其强弱判断极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素所谓极性乃是一种抽象概念,用以表示分子中电荷不对称的程度,大体上与偶极矩、极化度、介电常数等概念相对应官能团
6、的极性强弱比较3.吸附色谱吸附色谱法,是指用吸附剂作固定相,利用试样对吸附剂表面的吸附差异来进行分离分析的方法3.1 吸附色谱三要素(吸附剂、洗脱剂、试样)吸附剂一般是多孔性物质,具有较大的比表面积,在表面有许多吸附中心。常用的吸附剂有:硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性碳等 硅 胶吸附性来源于硅羟基硅羟基有三种 结合型 活性型 游离型 三种硅羟基吸附性强弱为:硅胶吸附剂的缺点:对弱酸性敏感的化合物会被破坏 氧化铝吸附性来源于铝原子上未公用电子对碱性吸附剂,适用于碱性(如生物碱)和中性化合物的分离缺点:有时会引起异构化、氧化、皂化、脱除氯化氢形成双键等副作用。聚酰胺通过形成氢键缔合而产生吸附;分子中的
7、酰胺羰基作为质子受体;或以酰胺键上的NH作为质子给体;适用范围:酚类、黄酮类、醌类。溶剂的极性溶剂的极性 溶剂的极性溶剂的极性:与介电常数大小一致与介电常数大小一致 环己烷环己烷 1.88 苯苯 2.29 无水乙醚无水乙醚 4.47 氯仿氯仿 5.20 极性递增极性递增 乙酸乙酯乙酸乙酯 6.11 乙醇乙醇 26.0 甲醇甲醇 31.2 水水 81.0 按照按照极性增强极性增强顺序,常用混合洗脱溶剂顺序,常用混合洗脱溶剂体系如下:体系如下:(己烷己烷/苯苯)(苯苯/乙醚乙醚)(苯苯/乙酸乙酯乙酸乙酯)(氯仿氯仿/乙醚乙醚)(氯仿氯仿/乙酸乙酯乙酸乙酯)(氯仿氯仿/甲醇甲醇)(丙酮丙酮/水水)(
8、甲醇(甲醇/水)水)三要素的相互关系 第三章 平面色谱法第一节 TLC的特点、技术参数第二节 TLC的制板、点样、展开、显色第三节 TLC的定性与定量分析第四节 TLC的应用第五节 纸色谱简介第一节 概 述1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家Stahl出版了“薄层色谱法”一书,推动了这一技术的发展。因TLC法设备简单,分析速度快,分离效率高,结果直观,很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪,和各步操作的仪器化,并实现了计算机化。薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。将试样点在色谱滤纸或层析板
9、的一端,并将该端浸在作为流动相的溶剂(常称之为展开剂)中,随着溶剂向上的移动,经过试样点时,带动试样向上运动。TLC特点 优点:优点:设备简单、操作方便、运行费用低;设备简单、操作方便、运行费用低;分离时间短,工作效率高;分离时间短,工作效率高;展开剂选择范围广,展开方式多样;展开剂选择范围广,展开方式多样;显色方便,检测手段丰富;显色方便,检测手段丰富;既可分析,又可制备;既可分析,又可制备;试样一般不需要经过严格预处理即可分离。试样一般不需要经过严格预处理即可分离。缺点:缺点:分离效率较低;不适用挥发性试样分离;定性定量不便。经典柱层析 吸附薄层层析 分离时间几小时 几分钟十几分钟 分离能
10、力 较差 强 吸附剂粒度 粗,一般100200目 细 应用范围 制备性分离 分析,小量制备 两者关系 TLC与高效液相色谱的比较固定相和流动相TLC流动相流动靠毛细作用力,流动相选择较少受限制,固定相不用再生。而 HPLC是在封闭的系统内,流动相流量靠泵控制,溶剂选择受检测器限制,固定相需再生。样品处理TLC要求没有HPLC严格。薄层色谱参数 比移值(比移值(Rf值)值):用来表征斑点位置的基本参数是保留因子,通常称作比移值,用Rf表示。Ls相对比移值理论塔板数:n=16(D/W)2理论塔板高度:H=L/n 分离度分离数:第二节 TLC的制板、点样、展开、显色黏合剂:无机黏结剂石膏(硫酸钙),
11、添加石膏的吸附剂以字母“G”表示。没有黏结剂的吸附剂以字母“H”表示。无机黏结剂的优点是:耐高温,耐酸碱,但涂铺薄板动作要快,否则匀浆易凝固;薄层强度差。有机黏结剂羧甲基纤维素钠(CMC-钠)、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。优点是薄层强度高、使用方便,缺点是不能用浓硫酸作显色。添加剂 荧光指示剂 硝酸银溶液制板、活化点样1.溶剂对样品的溶解度适中;2.溶剂沸点适中;3.样品浓度适中;4.原点位置应在展开剂液面上;5.定性分析:内径0.5mm管口平整的毛细管 定量分析:微量注射器6.TLC:原点直径最大不超过5mm,一般3mm;高效TLC:1-2 mm7.边缘效应 边缘效应展开剂选择的实践(一
12、):微量圆环法展开剂选择的实践(二):三角形法 展开剂选择的理论基础 展开剂的分类显色显色方法-日光下观察,划出有色物质的斑点位置-在紫外灯下(254nm或366nm),观察有 无荧光的产生,用硅胶G板-荧光淬灭法,适用于有紫外吸收的物质,用GF254板-显色剂显色,破坏性检出方法通用显色剂定性分析1.与标准对照品在三种不同的展开剂中展开(加熔点);2.制备TLC,将待定性化合物分离后,刮下、洗脱,再波谱分析;3.TLC与其它技术联用定量分析1.间接定量(洗脱测定法);2.直接定量(薄层扫描法)薄层扫描法:以一定波长的光照射展开后的薄层色谱板上被分离组分的斑点,测定斑点对光的吸收强度或所发出的
13、荧光强度,进行定量分析的方法。薄层吸收扫描法 薄层荧光扫描法第四节 TLC的应用 1.用于柱层析后相同组分的合并 2.有机合成监控反应,摸索最佳条件 3.制备有机化合物 4.中药材的鉴定第四章 气相色谱法第一节 概述第二节 气相色谱术语、理论第三节 填充柱气相色谱第四节 毛细管柱气相色谱第五节 裂解气相色谱及顶空气相色谱第六节 气相色谱仪第七节 衍生化气相色谱法第八节 气相色谱的定性与定量第九节 气相色谱的应用1.1.GCGC:以气体(即载气)为流动相的柱色谱分离技术。:以气体(即载气)为流动相的柱色谱分离技术。2.GC中常用作的载气的气体有中常用作的载气的气体有N2、He、H2、Ar。3.3
14、.GCGC中载气是惰性的,载气的功能仅仅是携带试样、洗中载气是惰性的,载气的功能仅仅是携带试样、洗脱组分。脱组分。4.4.GCGC的选择性主要取决于固定相和组分分子间的作用,的选择性主要取决于固定相和组分分子间的作用,所以可通过改变固定相来改变所以可通过改变固定相来改变GCGC的选择性。的选择性。第一节 概述GC按柱直径粗细分类按柱直径粗细分类1.填充柱:将固定相填充在内径4mm的金属管或玻璃管内2.毛细管柱:使用内径0.1mm-0.5mm的玻璃管或石英管 GCGC按分离机理分类按分离机理分类方方 法法 固固 定定 相相 应应 用用 气固色谱(气固色谱(GSCGSC)吸附剂吸附剂 (碳、分子筛
15、、高(碳、分子筛、高分子多孔小球)分子多孔小球)永久性气体、低沸点的烃永久性气体、低沸点的烃类,类,GDXGDX水水 气液色谱(气液色谱(GLCGLC)载体载体+固定液固定液(涂渍、键合)(涂渍、键合)应用很广应用很广 GC的特点1.分离效率高(填充柱上千块塔板;开管柱106块塔板)2.分析速度快3.样品用量少(检测限低,高灵敏检测器)4.缺点:(约20%样品适用)A.样品须能气化(350度下有一定的挥发性)B.热稳定性要好C.定性困难第二节第二节 气相色谱术语、理论气相色谱术语、理论1.气相色谱流出曲线气相色谱流出曲线2.分配系数与容量因子分配系数与容量因子3.3.塔板理论塔板理论4.4.速
16、率理论速率理论5.5.分离度分离度6.6.基本分离方程基本分离方程一、气相色谱流出曲线气相色谱流出曲线1.1.基线基线 仅有流动相(无试样)通过检测器时,检测到的信号为基线。2.2.保留值保留值 (1)用时间表示的保留值)用时间表示的保留值 保留时间(保留时间(tR):):从进样到某个组分的色谱峰顶点之间的时间间隔 死时间(死时间(tM):):不被固定相滞留的组分从进样开始、通过色谱柱、到出现峰最大值所需要的时间。调整保留时间(调整保留时间(tR):):tR=tRtM (2)用体积表示的保留值用体积表示的保留值 保留体积(保留体积(VR):):VR =tRF0 (F0为色谱柱出口处的载气流量,
17、单位:m L /min。)死体积(死体积(VM):):VM=tM F0 调整保留体积(调整保留体积(VR):):V R=VR VM 3.3.相对保留值相对保留值r r2121A.组分2与组分1的调整保留值之比(大于1):r21=tR2 /tR1=VR2/V R1=k2/k1=K2/K1B.它表示了固定相对这两种组分的选择性。C.亦称分离因子a、分配系数比、选择性系数、选择 因子 4.区域宽度区域宽度(1)标准偏差)标准偏差():0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。(2)半峰宽)半峰宽(Y1/2):0.5倍峰高处的宽度 Y1/2=2.355(3)峰底宽)峰底宽(Wb):Wb=4 Wb=1.699
18、 Y1/2 二、分配系数与容量因子二、分配系数与容量因子分配系数分配系数K:组分在两相间的浓度比容量因子容量因子k:组分在两相间的质量比;容量因子容量因子k与分配系数与分配系数K的关系为:的关系为:为相比:流动相体积与固定相体积之比填充柱的相比:535;毛细管柱的相比:50200容量因子越大,保留时间越长。容量因子越大,保留时间越长。可由保留时间计算出容量因子,两者有以下关系:可由保留时间计算出容量因子,两者有以下关系:三、塔板理论塔板理论把色谱柱看成一个精馏塔,沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相(固定相与流动相)间的分配行为,并引入理论塔板数作为衡量柱效高低的指标。当组分进入柱后,组分在
19、两相间进行多次分配,最后和固定相作用力较小的组分先从“塔顶”(即柱出口)逸出,从而与另一组分(和固定相作用力较大)分离色谱塔板理论的五点假设1.组分在气液两相间可瞬间完成分配平衡2.所有的物质在开始时全部进入零号塔板3.分配系数在每块塔板里都一样4.一个塔板和另一个塔板之间没有纵向扩散5.载气不是连续进入色谱柱,而是脉冲式进入色谱柱,即一个塔板体积的载气进入后,再进入另一个塔板体积的载气理论塔板数的计算理论塔板数的计算色谱柱长:色谱柱长:L,虚拟的塔板间距离:虚拟的塔板间距离:H,色谱柱的理论塔板数:色谱柱的理论塔板数:n,则三者的关系为:则三者的关系为:n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关
20、系为:理论塔板数与色谱参数之间的关系为:有效塔板数、有效塔板高度有效塔板数、有效塔板高度 组组分分在在死死时时间间内内不不参参与与柱柱内内分分配配,用用调调整整保保留留时时间代替保留时间,得有效塔板数和有效塔板高度:间代替保留时间,得有效塔板数和有效塔板高度:塔板理论的成功与不足塔板理论的成功与不足 塔塔塔塔板板板板理理理理论论论论能能能能成成成成功功功功解解解解释释释释色色色色谱谱谱谱峰峰峰峰的的的的形形形形状状状状(高高高高斯斯斯斯分分分分布布布布曲线)及评价柱效(计算曲线)及评价柱效(计算曲线)及评价柱效(计算曲线)及评价柱效(计算n n)。)。)。)。不不不不能能能能解解解解释释释释柱
21、柱柱柱效效效效和和和和流流流流动动动动相相相相流流流流速速速速的的的的关关关关系系系系;也也无无法法指指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。出影响柱效的因素及提高柱效的途径。四、速率理论四、速率理论 速率方程(也称范速率方程(也称范第姆特方程式)第姆特方程式):H=A+B/u+Cu H:理论塔板高度:理论塔板高度(cm),u:载气的线速度:载气的线速度(cm/s)1.1.涡流扩散项涡流扩散项A A=2dp dp:载体颗粒的平均直径:载体颗粒的平均直径:填充不均匀因子(与载体颗粒大小、分布、填:填充不均匀因子(与载体颗粒大小、分布、填充均匀性等有关)充均匀性等有关)2.2.分子扩散项(纵向扩散项)
22、分子扩散项(纵向扩散项)B/u B=2 Dg :弯曲因子(填充柱,弯曲因子(填充柱,=0.50.7;毛细管柱,毛细管柱,=1)Dg:试试样样组组分分分分子子在在气气相相中中的的扩扩散散系系数数(cm2s-1)。由由于于柱柱中存在着浓度差,产生纵向扩散:中存在着浓度差,产生纵向扩散:3.3.传质阻力项传质阻力项 Cu 组分在气相和液相两相间进行反复分配时,遇到阻力。组分在气相和液相两相间进行反复分配时,遇到阻力。传质阻力包括传质阻力包括气相传质阻力气相传质阻力Cg和和液相传质阻力液相传质阻力CL,液相传,液相传质阻力大于气相传质阻力。质阻力大于气相传质阻力。即:即:C=(Cg+CL)H u 曲线
23、结论曲线结论 A.A.涡流扩散项与流速涡流扩散项与流速u u 无关;无关;B.B.此曲线有一最低点,此点流速即此曲线有一最低点,此点流速即u uoptopt兼顾了分子扩散兼顾了分子扩散项和传质阻力项,使两者之和最小;项和传质阻力项,使两者之和最小;C.C.在在u uoptopt附近曲线平坦,因此可适当提高流速以节省时附近曲线平坦,因此可适当提高流速以节省时间,同时板高间,同时板高H H并没有增大多少;并没有增大多少;D.D.在低流速区在低流速区,分子扩散项占主导分子扩散项占主导,流动相使用重载气流动相使用重载气;E.E.在高流速区在高流速区,传质阻力项占主导传质阻力项占主导,流动相使用轻载气流
24、动相使用轻载气;采用较低固定液量采用较低固定液量 H=A+B/u+CuUopt Hmin 计算公式计算公式五、五、分离度分离度塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。分离度的表达式:定性定性时要求:R=1.0(相邻两峰分离程度98%)定量定量时要求:R=1.5(相邻两峰分离程度99.7%,基线分离基线分离基线分离基线分离,作为完全分离的标准)。六、基本分离方程六、基本分离方程 初始初始 k、N、对分离度的影响对分离度的影响增大增大k增大增大Nt 改变改变 第三节 填充柱气相色谱1.填充柱气相色谱用载体2.气液色谱用固定相3.气固色谱气-液色谱的特点:(1)固定液品种多,可选择范
25、围大;(2)可以根据需要选用合适的固定液用量,以改善分离效果;(3)气-液色谱在通常操作条件下有良好的对称峰;寿命长。气液色谱固定相:固定液 +载体(担体)载体,亦称担体,是支撑固定液的惰性多孔物质填充柱气相色谱用载体作为担体使用的物质应满足的条件:A.比表面积大,孔径分布均匀;B.化学惰性,表面无吸附性或吸附性很弱,与被分离组份不起反应;C.具有较高的热稳定性和机械强度,不易破碎;D.颗粒大小均匀、适度。一般常用6080目、80100目。载体分类:硅藻土:由二氧化硅(90%)和少量金属氧化 物组成 红色硅藻土:201红色担体 白色硅藻土:101白色担体 非硅藻土类:GDX、玻璃微球、氟担体等
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