液相色谱培训.pptx

HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱基础知识液相色谱基础知识HPLC Business DeptShimadzu Corporation一、色谱起源一、色谱起源石油石油醚醚碳酸碳酸钙颗钙颗粒粒色素色素色色谱谱组组分分HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法vv适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析分析分析分析vv流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法vv适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析vv流动相只起运载样品分子的能力流动相只起运载样品分子的能力流动相只起运载样品分子的能力流动相只起运载样品分子的能力 液相色谱基础知识HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLCHPLC的分离类型的分离类型的分离类型的分离类型l正相色谱正相色谱(NP-HPLC)l反相色谱反相色谱(RP-HPLC)l反相离子对色谱反相离子对色谱(RPIC)l离子交换色谱离子交换色谱(IEC)l空间排阻色谱空间排阻色谱(SEC)l手性化合物分离模式手性化合物分离模式(Chiral separation mode)HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱按两相极性不同分为:正相色谱反相色谱 化合物保留时间随流动相配比的变化 不同极性的化合物出峰顺序HPLC Business DeptShimadzu Corporation正相正相HPLC色谱柱色谱柱 硅胶型硅胶型 氰基型氰基型 氨基型氨基型 糖类分析糖类分析 二醇基型二醇基型 蛋白质分析蛋白质分析Silica gelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)Modified SiHPLC Business DeptShimadzu Corporation反相反相HPLC色谱柱色谱柱C18(ODS)type C8(octyl)typeC4(butyl)typePhenyl type TMS typeCyano type-Si-C18H37SiNon-polar propertyHPLC Business DeptShimadzu Corporation 色谱柱色谱柱:非极性非极性溶剂溶剂:极性极性水水/甲醇甲醇/乙腈乙腈反反 相相 色色 谱谱HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱流程图液相色谱流程图液相色谱流程图液相色谱流程图输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器溶溶剂剂数据数据处处理理HPLC Business DeptShimadzu Corporation流动相流动相流动相流动相流动相选择注意事项：流动相选择注意事项：纯度：采用纯度：采用“HPLC”级溶剂级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂剂对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小溶剂粘度要小与检测器相匹配与检测器相匹配流动相配制时的顺序流动相配制时的顺序HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶溶 剂剂 等等 级级水的等级水的等级纯化水纯化水蒸馏水蒸馏水去离子水去离子水波长波长(nm)纯化水纯化水去离子水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物纯化水中去除了无机和有机的污染物吸吸吸吸光光光光率率率率HPLC Business DeptShimadzu Corporation水水/MeOH梯度梯度ODS 柱柱鬼峰鬼峰Gradient Curve1 ml/min,0-100%MeOHover 10 mins and hold for15 mins.溶溶 剂剂 等等 级级鬼峰的出现鬼峰的出现鬼峰的出现鬼峰的出现HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶溶 剂剂 等等 级级溶剂的等级溶剂的等级HPLC级级优级纯优级纯分析纯分析纯都经过蒸馏和都经过蒸馏和0.45um的过滤的过滤(除纤维毛除纤维毛,未溶解的机械颗粒未溶解的机械颗粒)优级纯的纯度比分析纯大优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过级经过0.22um的过滤的过滤,且除去有紫外吸收的杂质且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱HPLC Business DeptShimadzu Corporation甲醇甲醇 乙睛乙睛 正己烷正己烷分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图溶溶 剂剂 等等 级级HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶剂前处理溶剂前处理溶剂前处理溶剂前处理 过滤：过滤：0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。过滤膜种类过滤膜种类 水系过滤膜水系过滤膜 有机系过滤膜有机系过滤膜HPLC Business DeptShimadzu Corporation30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.22m和0.45m两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.22m和0.45m两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.22m和0.45m两种规格。处理样品体积为7l。样品过滤头的类型：样品过滤头的类型：HPLC Business DeptShimadzu Corporation滤膜类型滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶剂前处理溶剂前处理溶剂前处理溶剂前处理 脱气脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响：气泡对测定的影响：1）柱压波动，流量偏小）柱压波动，流量偏小 2）基线波动）基线波动 返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation流路中形成气泡引起的问题流路中形成气泡引起的问题改变保留时间和峰面积改变保留时间和峰面积流动相中形成气泡对液流的不良影响流动相中形成气泡对液流的不良影响泵中形成气泡使液流波动泵中形成气泡使液流波动峰变形峰变形柱中气泡形成和累积使流动相绕流柱中气泡形成和累积使流动相绕流尖峰或锯齿状噪声尖峰或锯齿状噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声HPLC Business DeptShimadzu Corporation输液泵输液泵输液泵输液泵输液泵控制方式：输液泵控制方式：恒流控制恒流控制 恒压控制恒压控制输液泵类型：输液泵类型：注射泵注射泵 柱塞往复泵柱塞往复泵 隔膜泵隔膜泵HPLC Business DeptShimadzu Corporation柱塞往复泵柱塞往复泵单单向向阀阀马马达和凸达和凸轮轮柱塞杆柱塞杆柱塞杆密封圈柱塞杆密封圈泵头泵头10-100uLHPLC Business DeptShimadzu Corporation柱塞往复泵柱塞往复泵优点优点压力脉动小压力脉动小易于更换溶剂易于更换溶剂缺点缺点需要更换柱塞杆密封圈需要更换柱塞杆密封圈HPLC Business DeptShimadzu Corporation岛津岛津岛津岛津VPVP系列输液泵系列输液泵系列输液泵系列输液泵目的目的 单元单元 流速范围流速范围特性和应用特性和应用 分析分析 LC-10ADLC-10ADVPVP0.001-9.9990.001-9.999无脉动，适于无脉动，适于半微量半微量LC LC 和和 LC-MSLC-MS LC-10ATLC-10ATVPVP0.001-9.9990.001-9.999非凡的耐用性，非凡的耐用性，适于常量分析适于常量分析*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度HPLC Business DeptShimadzu Corporation等度洗脱等度洗脱输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器单单一或混合溶一或混合溶剂剂HPLC Business DeptShimadzu Corporation梯度洗脱梯度洗脱 A 泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器 B泵泵AB时间时间B 浓浓度度HPLC Business DeptShimadzu Corporation分析分析时间长时间长分离度差分离度差 MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODS type)等度洗脱等度洗脱HPLC Business DeptShimadzu Corporation95%30%MeOH 浓浓度度梯度洗脱梯度洗脱HPLC Business DeptShimadzu Corporation梯度洗脱：梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度提高分离精度注意事项：注意事项：v溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差v梯度混合的溶剂互溶性要好梯度混合的溶剂互溶性要好v梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）HPLC Business DeptShimadzu Corporation混合器混合器低低压压梯度比例梯度比例阀阀 高高压压梯度梯度低低压压梯度梯度脱气机脱气机高压高压/低压梯度系统低压梯度系统HPLC Business DeptShimadzu Corporation返回高压梯度系统高压梯度系统梯度准确度好梯度准确度好系统复杂系统复杂(需两台或三台泵需两台或三台泵)低压梯度系统低压梯度系统系统简单系统简单需在线脱气机需在线脱气机存在时间滞后效应存在时间滞后效应高压高压/低压梯度系统低压梯度系统HPLC Business DeptShimadzu Corporation进样器进样器进样器进样器自动进样器自动进样器手动进样器手动进样器 原理：（原理：（六通阀六通阀）注入方式：注入方式：1）全量注入全量注入 2）部分注入）部分注入返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation手动进样器的原理图手动进样器的原理图 装填状态装填状态进样状态进样状态返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation进样体体积 检检测测器器响响应应值值定量管体定量管体积的一半的一半3倍定量管体倍定量管体积全量注入全量注入部分注入部分注入进样体积与响应值关系进样体积与响应值关系返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation柱温箱柱温箱柱温箱柱温箱分析结果重现性好分析结果重现性好提高柱效提高柱效降低柱压降低柱压保证检测稳定性保证检测稳定性 柱温控制的优点：柱温控制的优点：HPLC Business DeptShimadzu Corporation色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱1）柱压低于）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱）色谱柱）2）柱温在柱温在40左右，最高使用温度为左右，最高使用温度为503）流动相）流动相PH使用范围为使用范围为27.5返回ODS柱的使用注意点：柱的使用注意点：HPLC Business DeptShimadzu Corporation流动相注意点流动相注意点流动相注意点流动相注意点离子对试剂的使用离子对试剂的使用具有缓冲盐流动相的使用具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开分析结束及开始始流动相平衡流动相平衡 加快平衡时间加快平衡时间异丙醇的使用异丙醇的使用HPLC Business DeptShimadzu CorporationLCLC检测器检测器检测器检测器紫外可见检测器（紫外可见检测器（UV/VIS）二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（PDA）示差检测器（示差检测器（RID）电导检测器（电导检测器（CDD）荧光检测器（荧光检测器（RF）电化学检测器（电化学检测器（L-ECD）质谱检测器（质谱检测器（MS）蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSD）HPLC Business DeptShimadzu Corporation紫外可见检测器紫外可见检测器紫外可见检测器紫外可见检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收性吸收定量基础：定量基础：Lambert-Beer定律，定律，AKCL优点：优点：1）对温度和流速变化不敏感）对温度和流速变化不敏感 2）可用于梯度分析）可用于梯度分析缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外可见检测器紫外可见检测器HPLC Business DeptShimadzu Corporation样样品池品池参比池参比池光光电电管管光光电电管管EinEinEin光光栅栅D2/W 灯灯l lEout紫外可见检测器紫外可见检测器HPLC Business DeptShimadzu Corporation岛津岛津岛津岛津VPVP系列紫外检测器功能系列紫外检测器功能系列紫外检测器功能系列紫外检测器功能1）设定时间程序（）设定时间程序（波长切换波长切换等）等）2）双波长检测双波长检测3）比例色谱比例色谱，初步判断峰的纯度，初步判断峰的纯度4）停泵扫描停泵扫描，确定组分最大吸收，确定组分最大吸收波长波长NEXTHPLC Business DeptShimadzu Corporation波长切换波长切换波长切换波长切换返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation双波长检测双波长检测双波长检测双波长检测返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation比例色谱比例色谱比例色谱比例色谱280nm220 nmratio280/220返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation波长扫描波长扫描波长扫描波长扫描返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（SPDSPDM10AVPM10AVP）二十一世纪标准紫外检测器二十一世纪标准紫外检测器色谱信息：色谱信息：保留时间保留时间 常规紫外检测器常规紫外检测器 紫外光谱紫外光谱 二极管阵列检测器二极管阵列检测器HPLC Business DeptShimadzu Corporation样样品池品池二极管二极管阵阵列（列（512个个单单元）元）光光栅栅D2/W灯灯每一每一单单元可元可检测检测一个一个波波长长下的吸光度下的吸光度二极管阵列检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器二极管阵列检测器HPLC Business DeptShimadzu Corporation三维谱图三维谱图三维谱图三维谱图时间波长吸光度色色谱谱光光谱谱HPLC Business DeptShimadzu Corporation二极管阵列检测器的优点二极管阵列检测器的优点二极管阵列检测器的优点二极管阵列检测器的优点1）采集三维谱图）采集三维谱图2）峰纯度检验峰纯度检验3）光谱库检索光谱库检索NEXTHPLC Business DeptShimadzu Corporation峰纯度检验（峰纯度检验（3 3点光谱图比较）点光谱图比较）Initial detection Initial detection pointpointFinal Final detection detection pointpointT1T3T2peak toppeak topup slopeup slopedown slopedown slope1/21/3HPLC Business DeptShimadzu Corporation乙酰水杨酸乙酰水杨酸下降点下降点上升点上升点,顶点顶点峰纯度检验（峰纯度检验（峰纯度检验（峰纯度检验（3 3点光谱图比较）点光谱图比较）点光谱图比较）点光谱图比较）返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation光谱库检索光谱库检索光谱库检索光谱库检索返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation检测器检测器检测器检测器原理：连续测定流通池中溶液折射率变化以测定原理：连续测定流通池中溶液折射率变化以测定 试样各组分浓度。试样各组分浓度。优点：通用型检测器优点：通用型检测器缺点：缺点：1）对温度和压力变化敏感）对温度和压力变化敏感 2）不能用于梯度分析）不能用于梯度分析示差折光检测器示差折光检测器返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation糖的色谱图Analytical ConditionsColumn:Shim-pack CLC-NH2Mobile phase:Acetonitrile/water =7/3Flow rate:1.0 mL/minTemperature:AmbientPeaks 1.甘油甘油 2.木糖木糖 3.果糖果糖 4.葡萄糖葡萄糖 5.蔗糖蔗糖 6.甘露糖甘露糖 7.乳糖乳糖HPLC Business DeptShimadzu Corporation荧光检测器荧光检测器荧光检测器荧光检测器原理原理原理原理:基于被分析组分发射的荧光强度进行检测基于被分析组分发射的荧光强度进行检测基于被分析组分发射的荧光强度进行检测基于被分析组分发射的荧光强度进行检测缺点缺点缺点缺点:仅适用于测定可产生荧光的物质仅适用于测定可产生荧光的物质仅适用于测定可产生荧光的物质仅适用于测定可产生荧光的物质优点优点优点优点:1):1)灵敏度极高灵敏度极高灵敏度极高灵敏度极高,是最灵敏的检测器之一是最灵敏的检测器之一是最灵敏的检测器之一是最灵敏的检测器之一 2)2)选择性好选择性好选择性好选择性好 3)3)对温度和流速不敏感对温度和流速不敏感对温度和流速不敏感对温度和流速不敏感,可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱可检测物质可检测物质可检测物质可检测物质:多环芳烃多环芳烃多环芳烃多环芳烃,霉菌毒素霉菌毒素霉菌毒素霉菌毒素,酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸,色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸,儿茶酚氨等儿茶酚氨等儿茶酚氨等儿茶酚氨等(具具具具有对称共轭体系有对称共轭体系有对称共轭体系有对称共轭体系)HPLC Business DeptShimadzu Corporation数据处理数据处理数据处理数据处理岛津液相色谱数据处理单元：岛津液相色谱数据处理单元：LC-Solution色谱工作站色谱工作站CLASS-VP色谱工作站色谱工作站CR7A色谱数据处理机色谱数据处理机CR8A色谱数据处理机色谱数据处理机返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱流程图液相色谱流程图输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器溶溶剂剂数据数据处处理理