激光共聚焦显微镜的样本.pptx
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1、荧光显微镜荧光显微镜 扫描型激光共聚焦显微镜扫描型激光共聚焦显微镜 上转换激光共聚焦显微镜上转换激光共聚焦显微镜吴艳吴艳分子影像与核医学研究中心分子影像与核医学研究中心401#1124荧光显微镜荧光显微镜Fluorescence microscopy 荧光显微镜是用来观察研究样品荧光现象的光荧光显微镜是用来观察研究样品荧光现象的光学显微镜,目前主要由光源、滤片系统、光路系统学显微镜,目前主要由光源、滤片系统、光路系统等组成。等组成。广泛应用在生命科学领域,可对组织和细胞的广泛应用在生命科学领域,可对组织和细胞的结构、形态、蛋白质表达、亚细胞结构等进行定位、结构、形态、蛋白质表达、亚细胞结构等进
2、行定位、定性观察及分析。定性观察及分析。荧光显微镜荧光显微镜仪器型号:仪器型号:OLYMPUS IX73 研究级倒置荧光显微镜研究级倒置荧光显微镜Fluorescence microscopy参加过仪器使用培训,通过参加过仪器使用培训,通过网上仪器知识考试,网上提网上仪器知识考试,网上提前预约,管理员审核通过方前预约,管理员审核通过方可使用。可使用。注意事项:注意事项:汞灯使用时尽量减少启动次汞灯使用时尽量减少启动次数;灯熄灭后要等待冷却才数;灯熄灭后要等待冷却才能重新启动;点燃灯泡后不能重新启动;点燃灯泡后不可立即关闭,以免水银蒸发可立即关闭,以免水银蒸发不完全而损坏电极,一般需不完全而损坏
3、电极,一般需要等要等15min 放置地点放置地点:401-1312室室 管理员:吴安庆老师管理员:吴安庆老师显微镜参数显微镜参数1主机功能:系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能;2透射光光源:外置电源供应器100W卤素灯透射光照明装置;3物镜:长工作距离万能平场半复消色差相差(荧光)物镜:4(数值孔径N.A.0.13)、10(N.A.0.3),20(N.A.0.7)、40(N.A.0.6),60X(N.A.0.7)4物镜转盘:6孔以上编码型物镜转盘,与软件连接后能够保存物镜信息,随物镜转换能够自动校准标尺;5载物台:精确定位功能手动载物台;具备XY锁定和复位功能,可重现标本位置,游标尺的
4、精度100m;6聚光镜:超长工作距离万能聚光镜,孔位数5;7荧光照明器:主机反射荧光系统可采用复眼照明技术,平均荧光视野亮度,便于量化分析;8.荧光光源:130W以上长寿命荧光光源,光导管传输,长度1.5米,符合RoHS 和WEEE法令要求;9.高通透性荧光激发块:紫外,BP340-390,DM410,BA420-IF 蓝色,BP460-495,DM505,BA510-IF 绿色,BP530-550,DM570,BA575-IF;10荧光激发块转盘:编码型荧光激发块转盘,7孔位设计,便于今后扩展应用,无需工具即可更换滤色镜组,与软件连接后能够随图片保存荧光滤色镜组信息;11滤色镜:透射用日光平
5、衡滤色片、绿色滤色片,荧光用减光片ND6/ND25;12DIC附件:40X、60X物镜配置微分干涉附件。显微镜参数显微镜参数 基本原理基本原理激发滤镜:激发滤镜:从光源中分滤出一定波长范围的激发光。从光源中分滤出一定波长范围的激发光。(一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片)(一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片)带通滤色镜带通滤色镜(BP)BP):有宽、窄带之分。如:有宽、窄带之分。如:BP450-490BP450-490 长、短通滤色镜组合长、短通滤色镜组合(LP LP+KPKP):):LP450+KP490LP450+KP490 双色镜:双色镜:双色分光镜;反射短波长,透过长波长。双色分光镜;反射短波
6、长,透过长波长。阻断滤镜:阻断滤镜:吸收和阻挡激发光进入目镜;选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。吸收和阻挡激发光进入目镜;选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。多为长通滤色镜;多为长通滤色镜;LP490LP490紫外蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光标本制作要求标本制作要求 (一)载玻片一)载玻片载玻片厚度应在载玻片厚度应在0.80.81.2mm1.2mm之间,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不之间,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光。有时需能使激发光在标本
7、上聚集。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。用石英玻璃载玻片。(二)盖玻片(二)盖玻片盖玻片厚度在盖玻片厚度在0.17mm0.17mm左右,光洁。左右,光洁。(三)标本(三)标本组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外,细胞重迭或杂质掩盖,影响判断。直接观察到的上部不充分激发。另外,细胞重迭或杂质掩盖,影响判断。(四)封裱剂(四)封裱剂封裱剂常用甘油,必须无自发荧光,无色透明,荧光的亮度在封裱剂常用甘油,必须无自发荧光,无色透明,荧光的亮
8、度在pH8.5pH8.59.59.5时较时较亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和0.5mol/l pH9.00.5mol/l pH9.09.59.5的碳酸盐缓冲液的等的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。量混合液作封裱剂。(五)镜油(五)镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无荧光镜油,也可用上述甘油代替。无荧光镜油,也可用上述甘油代替。注意事项注意事项:1 1、为延长汞灯寿命,打开汞灯后不可立即关闭,以免水银蒸发不完全而损坏电极,一般需要等15分钟后才能关闭。2
9、、汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动,否则灯内汞蒸气尚未恢复到液态,内阻极小,再次施加电压,会引起短路,导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电器,更重要的是汞蒸气溢出,将导致工作室污染。故关闭汞灯之后,不能马上再次打开,必须等待至少30分钟。开了不能马上关,关了不能马上开。开了不能马上关,关了不能马上开。荧光显微镜的不足荧光显微镜的不足:1.1.无法实现对荧光无法实现对荧光,透射光的同时采集透射光的同时采集,无法实现多重荧光的无法实现多重荧光的同时采集及共定位。同时采集及共定位。2.2.荧光散射光太强,造成实际分辨率的大大下降。荧光散射光太强,造成实际分辨率的大大下降。3.3.荧光漂白及对细胞组织的照射损
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