第6章分子生物学技术.pptx

第六章 分子生物学基本操作技术第一节 核酸的提取第二节 核酸杂交技术第三节 PCR技术第一节 核酸的提取一、提取核酸的基本步骤（一）总则保证核酸一级结构的完整性；其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度；核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；应尽量去除非目标核酸分子。（二）措施温度不要过高；控制pH值范围(pH值5-9)；保持一定离子强度；减少物理因素对核酸的机械剪切力；所用器械和一些试剂需高温灭菌；提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。（三）核酸分子抽提的技术设计1、核酸的释放-破裂细胞，释放核酸。高速组织捣碎机捣碎玻璃匀浆器匀浆超声波处理法液氮研磨法化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）生化法（溶菌酶、纤维素酶等）2、核酸的分离与纯化 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非目的核酸分子、试剂3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤4、核酸的鉴定浓度鉴定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液-紫外分光光度法。DNARNA浓度(g/ml)=OD260稀释倍数5040低浓度核酸溶液-溴化乙锭荧光光度法。纯度鉴定DNA:OD260/OD280=1.8；OD260/OD2302.0。RNA:OD260/OD280=1.7-2.0；OD260/OD2302.0。完整性鉴定-凝胶电泳法5、核酸的储存DNA：溶于pH8.0的TE（tris和EDTA）缓冲液中，4 或-20 保存；长期保存样品中可加入1滴氯仿。RNA：溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存;溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20 保存。或加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70。二、基因组DNA的分离与纯化（一）样品准备常见的标本：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞、细菌等。生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存70或液氮中。（二）DNA提取1、酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100150kb。主要试剂及其作用：EDTA：二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。SDS：溶解膜蛋白和脂肪，使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来；对RNA、DNA酶有抑制作用；与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。蛋白酶K：消化DNA酶和细胞中的蛋白质。可与SDS、EDTA同时使用，仍保持较高活性。酚：使蛋白质变性沉淀，抑制DNA酶活性。pH8.0的Tris溶液：使抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。酚或酚-氯仿中少许的异戊醇：减少气泡的产生，利于分相，保持分相的稳定性。2 甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤。适用于从标本中制备高分子量的DNA样品-可得200kb左右的DNA。3 玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。4 异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）。5 表面活性剂快速制备法：用Triton X-100或NP-40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。（三）DNA样品的纯化方法：透析、层析、电泳及选择性沉淀。琼脂糖电泳适用于0.1-60Kb片段，聚丙烯酰胺（PAGE）电泳适用于5-500bp大小的片段。琼脂糖含量（琼脂糖含量（W/V）线性线性DNA分离范围（分离范围（Kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2（四）DNA的浓缩1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量。2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。（六）DNA回收 主要是从电泳中分离回收DNA片段。回收原则：尽量提高回收率，去除回收DNA样品中的污染物。电泳到DEAE-纤维素膜：500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。透析袋电洗脱：低熔点琼脂糖凝胶：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子杂交分子。第二节 核酸杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理1、DNA的变性(denaturation)：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子的过程。常用的变性方法：热变性；酸碱变性；化学试剂变性 2、DNA的复性（renaturation)：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。3、解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)：使50%的DNA发生变性时的环境温度。增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。减色效应：变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。单链核酸的起始浓度：浓度越高，复性越快。核酸链长度：越长，形成配对的难度越大，复性也慢。核酸分子的复杂性：复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。影响复性的因素 温度：温度过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度是比Tm低25。离子强度：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性。但离子强度过高也不利于复性。Tm值与核酸含量的关系 20bp Tm=69.3+0.41(GC)%4、杂交来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA之间的杂交。核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA或RNA片段上带上可检测的标记，可用来检测样品中未知的核酸序列。探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。离子强度：高离子强度溶液中，有利于杂交分子形成。影响核酸分子杂交的因素 温度：通常在低于Tm 20-25的温度下进行杂交。添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。杂交液中的甲酰胺。甲酰胺可降低核酸杂交的Tm。含30%50%甲酰胺的杂交温度能降低到3042。较低的杂交温度，使探针更稳定，并能更好地保留非共价结合的核酸。4、预杂交 为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂交前的这些处理过程称为预杂交。常用于预杂交的封闭物变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在杂交反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhardt溶液，包含聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。二、核酸探针 指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。核酸探针的类型：寡核苷酸探针、基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、单链DNA探针。常用的探针标记物：放射性同位素（3H、32P、35S、125I）；非放射性同位素（生物素、地高辛、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等）。三、核酸分子杂交信号的检测放射性同位素标记探针：放射自显影。非放射性同位素标记探针：偶联反应+显色反应。四、核酸分子杂交技术固相杂交：结合于某种固相支持物上的待测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中进行杂交反应。（一）膜上印迹杂交 将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程称为膜上印迹杂交。印记的方法：虹吸印迹法；真空转移法；电转移法DNA或RNA电泳分离核酸片段 转移至固相支持物（印迹技术）杂交洗去未杂交探针杂交信号检测Northern 杂交 原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。方法：提取组织细胞总RNARNA定量变性胶电泳转膜干膜预杂交杂交洗膜压片洗片图像分析Western印迹杂交 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。斑点印迹杂交和狭线印迹杂交适于核酸样品定量检测。（二）原位杂交 用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。取材组织、细胞固定预杂交杂交放射自显影或免疫酶法显色观察结果 （三）液相杂交1.RNA酶保护分析法2.核酸酶S1保护分析法待测RNA样品液相杂交DNA-RNA杂交双链酶解杂交体系纯化脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影 核酸酶S1（专一降解未杂交的DNA和RNA单链）单链DNA探针（M13体系合成）待测RNA样品液相杂交RNA-RNA杂交双链酶解杂交体系纯化脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影 单链RNA探针RNA酶（专一降解未杂交的RNA单链）聚合酶链式反应：在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。第三节 PCR技术PCR反应的特点特异性强：引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性。灵敏度高：指数增长，从pg(10-12)可扩增至 mg(10-6)水平 简便、快速：2-4 小时完成扩增。对标本的纯度要求低：DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94 C 95 C 退火（annealing）:40 C 70 C 延伸（extension）:72 C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。二、PCR的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。1、模板（template）包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。模板DNA需较高的浓度RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为扩增的模板。模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng2、引物（Primers)引物是化学合成的寡核苷酸片段，它决定了PCR扩增产物的特异性和长度。化学合成的寡核苷酸能与模板特异地结合引物决定产物的特异性和长度引物设计时必须遵循一些原则 设计引物的原则二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补。长度为18-25个核苷酸。二条引物之间避免形成引物二聚体。引物的碱基组成应平衡。引物的5端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）引物浓度：0.1 0.2 umol/L,浓度过高容易生成引物二聚体。3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致。浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加。dNTP浓度：20 200 umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。4、DNA聚合酶从一种生活在热泉（8090）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus,Taq）中提取，有很高的热稳定性。Taq 酶的作用:在模板指导下，以dNTP为原料，于引物3-OH末端处加上脱氧单核苷酸，形成3,5-磷酸二酯键，使DNA链沿53方向延伸，催化DNA合成。最适酶量：1-2.5U。酶量过多，导致非特异性扩增。5、镁离子浓度 镁离子浓度对于Taq 酶的活性有直接影响。PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的均可与Mg2+结合，降低游离Mg2+的浓度，从而影响酶的活性。当dNTP浓度为200umol/L，MgCl2的浓度为1.5mmol/L时较适宜。（二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）1、温度 变性温度：94 97 退火温度：低于引物Tm 5 左右 温度过高-降低扩增效率；温度过低-增加非特异性扩增延伸温度：72，此时Taq酶具有较高的酶促活性2、时间 第一次变性应给予足够时间（5 7分钟）每个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增。3、循环次数 重复次数一般设为2535个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。三、PCR中试剂与样本的保存1、裂解液 4贮存，避免反复冻融，否则影响裂解效果，造成假阴性。2、反应液 -20贮存。试剂开封后，4保存在12周内用完。反应液反复冻融5次影响不大，但过多的冻融会降低扩增效率。（一）试剂贮存3、Taq酶 -20贮存（存于有霜冰箱）。4、阳性模板 -20贮存，可反复冻融5次左右。阳性模板4也可贮存2周左右。1、尿道、阴道、宫颈分泌物 棉拭子经生理盐水洗涤后，2000r/min后取上清500ul。过多的沉淀物裂解后，会导致PCR抑制而产生假阴性结果，或出现电泳背景模糊和拖尾现象。尤其是脓性分泌物，沉淀物过多，易造成假阴性。（二）标本处理2、尿液 男性尿道炎患者，若无分泌物，可用初段尿。尿液置冷冻保存，但解冻后需37保温，以使尿盐充分溶解，过多的盐沉积物会抑制PCR。3、血清 乙型肝炎病毒，血清可置4贮存几天，-20贮存三个月以上不影响检测结果，经多次冻融也不影响检测结果。丙型肝炎病毒等，血清必须置-20贮存，一般冻融3次以上便会影响检测结果，导致假阴性。4、全血 尽快处理（一般不超过24h），因为白细胞会随时间的延长而减少。处理时尽量将红细胞去除干净。红细胞末去除干净，将干扰PCR，导致扩增效率下降。5、痰液 先用1N NaOH液化，3750可缩短液化时间，长时间的液化（过夜或数天）不影响结核菌的检测。痰液消化后，均要用蒸馏水洗涤离心沉淀物1-2次，否则，沉淀物过碱而抑制PCR。6、胸水、脑脊液 胸水、脑脊液标本离心所得沉淀物极少，加裂解液的量也要相应减少。为保证裂解充分，可在管内滴入1-2滴石蜡油后再裂解。（三）样本保存 送检标本不能及时处理，除全血外，均可置-20保存数天。处理好的标本可置-20保存。检测时需将解冻后的标本充分振荡，经100水浴5min，离心后取上清液检测。以PCR为基础的相关技术逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)定量PCR(quantitative PCR)多重PCR(multiplex PCR)免疫PCR差异显示PCR(differential display PCR,DD-PCR)PCR诱导定点突变原位PCR(in situ PCR)PCR技术在分子诊断中的应用感染性疾病中病原微生物核酸的检测单基因遗传性疾病的基因诊断多基因病相关基因的检测肿瘤相关基因的检测移植配型和法医学上的应用