生命科学基础实验教学示范中心.pptx
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1、第一章第一章 蛋白质(酶)、核酸的分离纯化蛋白质(酶)、核酸的分离纯化第三章第三章 层析技术层析技术第二章第二章 离心技术离心技术第四章第四章 电泳技术电泳技术第一章第一章 蛋白质(酶)、核酸的分离纯化蛋白质(酶)、核酸的分离纯化第一节第一节引言引言 一、分离纯化的意义一、分离纯化的意义二、分离纯化的要求二、分离纯化的要求三、分离纯化的一般程序三、分离纯化的一般程序第二节第二节蛋白质(酶)、核酸分离纯化的前处理蛋白质(酶)、核酸分离纯化的前处理 一、材料的选择与预处理一、材料的选择与预处理 二、细胞的破碎二、细胞的破碎 三、细胞器的分离三、细胞器的分离 四、提取四、提取第三节第三节分离纯化分离
2、纯化 一、一、粗提纯粗提纯 二、二、精提纯精提纯 三、三、纯度鉴定纯度鉴定第四节第四节生物大分子的浓缩、干燥及保存生物大分子的浓缩、干燥及保存 第一节第一节引言引言n蛋白质(酶)、核酸存在于一切生物体中,蛋白质(酶)、核酸存在于一切生物体中,是非常重要的生物大分子;是非常重要的生物大分子;n蛋白质是生物功能的执行者,担负着生物催蛋白质是生物功能的执行者,担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能;识别等多种生理功能;n核酸是遗传信息的携带者,在生物体中指导核酸是遗传信息的携带者,在生物体中指导各种蛋白质的合成。各种蛋白质的合成。性
3、质性质 方法方法v分子大小分子大小 透析、超滤、差速离心、凝胶过滤透析、超滤、差速离心、凝胶过滤v溶解度溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀v电荷电荷 电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析v吸附性质吸附性质 吸附层析吸附层析v对配体分子对配体分子 的生物亲和力的生物亲和力 亲和层析亲和层析生物大分子的分离纯化的方法很多,主要是根据分子之间特异生物大分子的分离纯化的方法很多,主要是根据分子之间特异性的差异,如分子大小性的差异,如分子大小、溶解度、电荷等建立起来的。、溶解度、电荷等建立起来的。一、分离纯化的意义一、分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质、核酸,研究
4、其从生物材料中分离制备蛋白质、核酸,研究其结构与功能,对于了解生命活动的规律,阐明结构与功能,对于了解生命活动的规律,阐明生命现象的本质有重大意义;生命现象的本质有重大意义;工业生产的需要:食品、发酵、纺织、制革等工业生产的需要:食品、发酵、纺织、制革等工业,需要大量的高活性的酶制剂;工业,需要大量的高活性的酶制剂;(如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等)(如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等)医疗的需要:如用猪胰岛素治疗糖尿病;医疗的需要:如用猪胰岛素治疗糖尿病;基因工程的需要。基因工程的需要。二、分离纯化的要求二、分离纯化的要求1、纯度纯度:主要取决于研究的目的和应用上的要
5、求。如作:主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功为研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂,都要求均一;工业、医药方面应用的酶析的酶制剂,都要求均一;工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂,达到一定纯度即可,不要求均一。和蛋白质制剂,达到一定纯度即可,不要求均一。2、活性活性:要求大分子保持天然构象状态,有高度的生物:要求大分子保持天然构象状态,有高度的生物活性。活性。3、收率收率:希望收率越高越好,但在分离纯化过程中总有:希望收率越高越好,但在
6、分离纯化过程中总有不少损失,而且提纯步骤越多,损失越大。不少损失,而且提纯步骤越多,损失越大。三、分离纯化的一般程序三、分离纯化的一般程序生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段:生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段:材料的选择和预处理;材料的选择和预处理;破碎细胞及提取(有时还需要进行细胞器的分离);破碎细胞及提取(有时还需要进行细胞器的分离);分离纯化:包括粗分级分离和细分级分离。分离纯化:包括粗分级分离和细分级分离。其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。第二节第二节蛋白质(酶)、核酸蛋白质(酶)、核酸分离纯化的前处理分离纯化的前处
7、理一、材料的选择与预处理一、材料的选择与预处理n选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题,只要能达到实验目的即可。虑上述问题,只要能达到实验目的即可。n实验材料选定后,常常需要进行预处理,如动物材料实验材料选定后,常常需要进行预处理,如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织;植需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织;植物种子需要除壳;微
8、生物需要将菌体与发酵液分开。物种子需要除壳;微生物需要将菌体与发酵液分开。另外,必须尽可能保持材料的新鲜,尽快加工处理,另外,必须尽可能保持材料的新鲜,尽快加工处理,若不立即进行实验或加工,应冷冻保存。若不立即进行实验或加工,应冷冻保存。二、细胞的破碎二、细胞的破碎n分离提取某一生物大分子,首先要求生物大分子从分离提取某一生物大分子,首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保持原来的天然状态,不丢失其生物活性。因此应选持原来的天然状态,不丢失其生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液择适当的方法将组织和细胞
9、破碎。但若材料是体液(如血)或生物体分泌到体外的分泌物,则不必进(如血)或生物体分泌到体外的分泌物,则不必进行组织细胞的破碎。行组织细胞的破碎。n组织细胞的破碎方法很多,根据不同的实验规模,组织细胞的破碎方法很多,根据不同的实验规模,不同的实验材料和实验要求,使用的破碎方法和条不同的实验材料和实验要求,使用的破碎方法和条件也不同件也不同。v一般动物组织和细胞可用一般动物组织和细胞可用电动捣碎机电动捣碎机或或匀浆器匀浆器破碎或用破碎或用超声波超声波处理破碎;处理破碎;v植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁,一般常用与石英砂
10、和适当的提取液一质组成的细胞壁,一般常用与石英砂和适当的提取液一起起研磨研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的;的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的;v细菌细胞的破碎比较困难,因为整个细菌细胞壁的骨架细菌细胞的破碎比较困难,因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子,非实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子,非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理(以分解肽聚糖)。高压挤压或溶菌酶处理(以分解肽聚糖)。三、细胞器的分离三、细胞器的分离n细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网,植
11、物细胞细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网,植物细胞还有叶绿体。还有叶绿体。n如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子,为了如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子,为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染,还需防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染,还需先将细胞器分离出来,然后在某一细胞器中分离某一物质。先将细胞器分离出来,然后在某一细胞器中分离某一物质。n细胞器的分离一般采用细胞器的分离一般采用差速离心法差速离心法,即将破碎后的细胞在,即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心,常用的介质有适当的介质中进行离心,常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二
12、醇檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同,经等。各种细胞组分按质量大小的不同,经过不同速度的离心后,沉降于离心管的不同部位,经多次过不同速度的离心后,沉降于离心管的不同部位,经多次分步离心后,即可获得所需组分。分步离心后,即可获得所需组分。四、提取四、提取n组织细胞破碎过程中,大量的胞内酶及细胞内含组织细胞破碎过程中,大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来,必须立即将其置于一定条件下和物被释放出来,必须立即将其置于一定条件下和溶剂中,让制备物充分溶解,并尽可能保持原来溶剂中,让制备物充分溶解,并尽可能保持原来的天然状态,避免因长久放置造成制备物的分解的天然状态,避免因长久放置造成制备物的分
13、解破坏,这就是破坏,这就是提取提取。提取实际上就是将制备物从复杂的生物体系中转移到提取实际上就是将制备物从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中(通常是水、缓冲液、稀盐溶液特定的人工液相体系中(通常是水、缓冲液、稀盐溶液或有机溶剂)。或有机溶剂)。1、蛋白质(酶)的提取蛋白质(酶)的提取n大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中,大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中,故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液,如似生理条件下的缓冲液,如20-50m mol/L的磷酸盐的磷酸盐缓冲液(缓冲液(pH7.0-7
14、.5)或)或0.1mol/L Tris-HCl(pH7.5-8.0)缓冲液作提取液。)缓冲液作提取液。n对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸,常在提蛋白质和酶,不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸,常在提取液中加入适量的有机溶剂,如乙醇、丙酮、异丙醇、取液中加入适量的有机溶剂,如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。正丁醇等。2、核酸的提取核酸的提取nDNA和和RNA在细胞中常与蛋白质结合,以核蛋在细胞中常与蛋白质结合,以核蛋白的形式存在。白的形式存在。nDNA的提取的提取:一般是利用:一般是利用DNA-核蛋白(核蛋白
15、(DNP)易溶于易溶于1mol/L NaCl溶液。溶液。nRNA的提取的提取:利用:利用RNA-核蛋白(核蛋白(RNP)易溶于)易溶于0.14mol/LNaCl溶液,先提取得到溶液,先提取得到RNP。提取得到提取得到DNP或或RNP后,再将蛋白质除去即可后,再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。得到相应的核酸。n蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。n去污剂法去污剂法是利用是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合,从而使核酸与蛋白质分开。然后加入荷的侧链结合,从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液,使浓醋酸
16、钾溶液,使SDS-蛋白质复合物沉淀,并使多余蛋白质复合物沉淀,并使多余的的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。n有机溶剂法有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂,当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形剂,当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液,蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性,与核成乳状液,蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性,与核酸分开。离心后可分为两相,一般上层为含核酸的水酸分开。离心后可分为两相,一般上层为含核酸的水相,下层为有机相,交界处是变性凝聚的蛋白质层。相,下层为有机相,交界处是变性凝聚的蛋白
17、质层。最后利用乙醇或异丙醇将核酸沉淀离心收集即可。最后利用乙醇或异丙醇将核酸沉淀离心收集即可。蛋白质的去除蛋白质的去除 第三节第三节 分离纯化分离纯化n从细胞中提取得到的生物大分子往往是不从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的,含有大量杂质,必须进一步分离纯净的,含有大量杂质,必须进一步分离纯化,这一阶段可分为纯化,这一阶段可分为粗分级分离和细分粗分级分离和细分级分离级分离两步进行。两步进行。一、粗提纯一、粗提纯1.蛋白质的粗提纯蛋白质的粗提纯主要是利用主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀沉淀等方法,使目的蛋白与其它较大量的等方法,使目的蛋白与其它较大量的
18、杂蛋白分开。这些方法的特点是简便,处杂蛋白分开。这些方法的特点是简便,处理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白质,但分辨率低。白质,但分辨率低。(1)盐析盐析l向蛋白质溶液中加入大量的中性盐向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(NHNH4 4)2 2SOSO4 4,NaNa2 2SOSO4 4,NaClNaCl,使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀,这种现象称为盐析。使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀,这种现象称为盐析。l盐析作用是由于当盐浓度较高时,盐离子与水分子作用,使水盐析作用是由于当盐浓度较高时,盐离子与水分子作用,使水的活度降低,原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的
19、水化的活度降低,原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水,从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用,水,从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用,破坏蛋白破坏蛋白质分子表面的水化层质分子表面的水化层。l 不同的蛋白质分子,由于其分子表面的极不同的蛋白质分子,由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同,其水性基团的种类、数目以及排布的不同,其水化层厚度不同,故盐析所需要的盐浓度也不化层厚度不同,故盐析所需要的盐浓度也不一样,因此调节蛋白质中盐的浓度,可以使一样,因此调节蛋白质中盐的浓度,可以使不同的蛋白质分别沉淀。如:不同的蛋白质分别沉淀。如:血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(
20、NH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出分段盐析分段盐析(2)等电点沉淀等电点沉淀n蛋白质是两性电解质,其溶解度与其净电荷数蛋白质是两性电解质,其溶解度与其净电荷数量有关,随溶液量有关,随溶液pH变化而变化。在溶液变化而变化。在溶液pH值值等于蛋白质等电点时,蛋白质的溶解度最小。等于蛋白质等电点时,蛋白质的溶解度最小。n不同的蛋白质有不同的等电点,因此通过调节不同的蛋白质有不同的等电点,因此通过调节溶液溶液pH到目的蛋白的等电点,可使之沉淀而与到目的蛋白的等电点,可使之沉淀而与其它蛋白质分开,从而除去大量杂蛋白。其它蛋白质分开,从而除去大量杂蛋白。(3)
21、有机溶剂法有机溶剂法n与水互溶的极性有机溶剂如与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。n有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个:有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个:v降低水的介电常数降低水的介电常数,使蛋白质分子表面可解离,使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱,水化程度降低,促进基团的离子化程度减弱,水化程度降低,促进了蛋白质分子的聚集沉淀。了蛋白质分子的聚集沉淀。v是极性有机溶剂是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水与蛋白质争夺水化水,而使蛋,而使蛋白质分子沉淀。白质分子沉淀。n室温下,这些有机溶剂不仅能使蛋
22、白质沉淀,室温下,这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀,而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却,然而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中,后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中,防止有机溶剂局部浓度过高,则在很大程度上防止有机溶剂局部浓度过高,则在很大程度上解决变性问题。解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同,发生沉淀不同的蛋白质由于水化层厚度不同,发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同,因此可利用不同浓需要的有机溶剂浓度不同,因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。度的有机溶剂分离不同的蛋白质。2.核酸的粗提纯核酸的粗提纯n从细胞中提取得到的核酸,常混杂有
23、蛋白质及各种从细胞中提取得到的核酸,常混杂有蛋白质及各种大小的核酸同类物等杂质,可采用适当方法进行粗大小的核酸同类物等杂质,可采用适当方法进行粗提纯。提纯。n粗提纯中,进一步将蛋白质除去粗提纯中,进一步将蛋白质除去,可用去污剂或有机可用去污剂或有机溶剂多次反复提取。溶剂多次反复提取。n从从RNA除去混杂的除去混杂的DNA,可用,可用DNAase将将DNA降解降解掉。掉。n从从DNA中除去混杂的中除去混杂的RNA,可用,可用RNAase将将RNA降降解掉。解掉。二、精提纯二、精提纯1.蛋白质精提纯蛋白质精提纯一般蛋白质样品经粗制分级后,体积较小,杂质一般蛋白质样品经粗制分级后,体积较小,杂质大部
24、分被除去。进一步提纯,通常使用高分辨率的大部分被除去。进一步提纯,通常使用高分辨率的柱层析及电泳柱层析及电泳方法。方法。常用的柱层析方法有凝胶过滤、离子交换层析、常用的柱层析方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析。吸附层析、亲和层析。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。焦电泳。另外,结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一,制另外,结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一,制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。n核酸样品进行精提纯,一般常用核酸样品进行精提纯,一般常用超离心、电泳、超离心、电泳、柱层析柱层
25、析等方法。等方法。n超离心包括超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心速度区带离心、沉降平衡超离心。n电泳包括电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。前者凝胶孔径小,适合分离前者凝胶孔径小,适合分离1000个核苷酸以下的核个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大,适合分离较大的核酸分子。酸分子。后者孔径大,适合分离较大的核酸分子。n柱层析主要有柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析羟基磷灰石柱层析。2.核酸核酸精提纯精提纯三、三、纯度鉴定纯度鉴定n生物大分子经过分离提纯,最后还要鉴定制品生物大分子经过分离提纯,最后还要鉴定
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