2023-2024外泌体行业发展白皮书.pdf
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1、02前言当下,肿瘤创新药发展日新月异,随着以 PD-1/PD-L1 为代表的免疫检查点抑制剂、CAR-T 细胞疗法、TIL 疗法等创新药的陆续获批上市,整个格局呈现出了多样化的发展趋势,各个细分赛道蓬勃发展。其中,外泌体(exosome)是由细胞多囊泡体(MVB)与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的膜性囊泡。外泌体作为细胞间通讯的重要媒介,具有传递信息、调节细胞功能等关键作用,其组成和功能多样性为疾病诊断、治疗及药物递送提供了全新的视角,为肿瘤免疫治疗领域带来了新的希望,正在引起广大研究者的极大关注。纯化的“天然”外泌体已在人体中显示出良好的安全性,同时,为了提高外泌体的精准靶向递送和载药物,
2、科学家们正在设计工程化外泌体,通过工程化赋能,外泌体可以实现更高效、更安全的药物递送。尽管化外泌体在肿瘤治疗中具有巨大的潜力,但外泌体这一赛道还面临许多挑战。外泌体具有异质性,其制备和纯化技术仍需进一步完善;且外泌体非常复杂,外泌体的鉴定和检测尚未形成明确的标准。不过目前国内外已经多诸多企业布局外泌体赛道,国外进展较快的企业包括 EVOX Therapeutics、Capricor Therapeutics、Direct Biologics 等,国内聚焦外泌体分离、提纯、检测、新药研发、递送、诊断等业务的企业已经超过 60 家。整体来看,外泌体行业还处于早期发展阶段,不过国内外泌体行业的产业化
3、已经初具雏形,未来发展潜力巨大。03目录前言.02第一章 外泌体概述.041.1 外泌体的组成和功能.041.2 外泌体的来源.061.3 常见的分离方法.061.4 外泌体鉴定.071.5 工程化赋能外泌体.08第二章 外泌体的应用趋势:从“细胞垃圾”到“明日之星”.112.1 诊断检测.112.2 疾病治疗.122.3 药物递送.122.4 其他应用.142.5 临床转化进展.15第三章 外泌体产业化初具雏形,为商业化奠定基础.173.1 外泌体产业化的机遇与挑战.173.2 市场前景可期.18第四章 外泌体企业盘点:国外群雄逐鹿,国内高速崛起.204.1 国外领军企业.204.2 国内代
4、表企业.23第六章 监管政策.37免责声明.3904第一章 外泌体概述外泌体(exosome)是由细胞多囊泡体(MVB)与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的膜性囊泡,直径约为 30-100nm。其天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液和母乳,被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中,通过循环系统到达其他细胞与组织,产生远程调控作用。外泌体于 20 世纪 80 年代早期首次在绵羊网织红细胞中被发现;1987 年 Johnstone 将其命名为“Exosome”;2013 年,细胞内部囊泡运输调控机制获“诺贝尔生理或医学奖”,推动外泌体的研究加速发展;发展至今,外泌体已经被广泛应用于
5、诊断检测、疾病治疗、药物递送等热门领域。1.1 外泌体的组成和功能外泌体具有脂质双层膜结构,携带来自不同组织和器官细胞的各种类型的大分子,主要包括蛋白质、核酸和脂类。外泌体中常见的蛋白质有 Rabs 蛋白、膜联蛋白、四跨膜蛋白、热休克蛋白、多种的代谢类的酶等;核酸则包括 microRNA、mRNA、lncRNA、tRNA 等;脂类包含鞘磷脂、磷脂酸神经酰胺和胆固醇等。(外泌体发生、分泌过程及组成,图源:参考资料 1)05当含有多种内容物的外泌体释放到细胞外后,在组织液中移动到邻近的靶细胞,或在循环中移动到远处的靶细胞,并将信号传递给靶细胞,主要通过以下几种途径:(1)外泌体上的跨膜蛋白直接作用
6、于受体细胞膜表面的信号分子,激活细胞内信号级联;(2)外泌体膜与细胞膜融合,将外泌体的内容物直接送入靶细胞内;(3)外泌体通过吞噬作用或内吞作用进入细胞。在很长一段时间内,外泌体被认为是细胞排泄废物的一种方式,而随着研究的深入,发现外泌体具有多种多样的功能,其功能取决于其所来源的细胞类型,可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等过程中,发挥不同功能。(外泌体的功能和作用,图源:参考资料 1)061.2 外泌体的来源几乎所有类型的细胞,都可以产生并释放外泌体。根据不同生物来源分类,外泌体可分为动物细胞外泌体、植物外泌体、微生物外泌体。哺乳动物中无论是“健康细胞”还是“病理细
7、胞”均可以分泌外泌体。在循环外泌体中,有 80-90%来自血小板、淋巴细胞、树突状细胞、其他免疫细胞,通过循环系统到达其他细胞与组织产生远程调控作用。目前,可通过 GMP 大规模生产获得的动物细胞外泌体主要包括:牛奶外泌体、人心脏祖细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪干细胞外泌体、树突状细胞外泌体、HEK293 细胞外泌体等。1.3 常见的分离方法为了在研究和临床中更加有效地利用外泌体,从生物样品中精确地将外泌体分离出来至关重要。目前分离外泌体主要有超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫亲和法、分子排阻色谱法、微流控技术和试剂盒法,这 8 种方法各有优点和不足。(1)超速离
8、心法:这是基于溶液中不同物质的沉降系数不同的原理,超速离心法得到的外泌体量多,是最为常用的分离方法之一,但这种方法得到的外泌体纯度不足,整个过程耗时较长且需要昂贵的大型仪器。(2)密度梯度离心法:通过密度不同的原理可以将外泌体与其他杂质分开,提取的外泌体纯度较高,但过程繁琐,耗时较长而得到的量较少。(3)超滤法:通过截留不同相对分子质量的超滤膜进行选择性分离,分子小的物质会被过滤到膜的另一侧,该方法便于操作,但外泌体可能会阻塞过滤孔而降低分离效率,不适合含杂质较多的样本。(4)聚合物沉淀法:高度亲水的聚合物与外泌体周围的水分子相互作用,形成疏水性微环境,从而导致外泌体沉淀。这种方法分离的外泌体
9、纯度不高,回收率较低,可能会产生难以去除的聚合物。(5)免疫亲和法:用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合可将外泌体吸附07并分离出来,该方法可以获得不同的外泌体亚型,特异性高且操作简便,但其产量较低外泌体生物活性易受 pH 和盐浓度影响。(6)分子排阻色谱法:是利用分子尺寸大小来分离外泌体的色谱分离技术,通过外泌体和其他蛋白质等颗粒大小的不同来分离出高纯度的外泌体。但是该方法耗时较长,不适合大量样本的处理。(7)微流控技术:这是一种新兴的是基于微小流体的技术,具有分离速度快、纯度高、集成度高等优点,但对大体积样本的处理能力弱且制作工艺复杂。(8)试剂盒法:市场上已出现各种商业化的外泌
10、体提取试剂盒,无需特殊设备,提取效率和纯化效果较高,操作便捷,不过不同商家的产品纯化效果良莠不齐,不适用于大批量样本的处理。尽管方法众多,但尚没有一种方法能够解决包括批次间差异、产量低、纯度低在内的所有挑战,目前业内认为,将这些方法交叉结合起来将是改善分离结果的具有前景的策略。1.4 外泌体鉴定由于分离纯化手段的限制,难以获得纯度高且单一性强的外泌体,因此后续需要通过多种实验来评估外泌体样品的纯度和完整性。目前外泌体的鉴定主要包括电镜成像、粒径检测和 Western Blot 检测。第一章 电镜成像:通过透射电子显微镜(TEN)或扫描电子显微镜(SEM)可以直观地观察外泌体形态和大小,但电镜会
11、有背景的干扰,且无法区分外泌体和与其形态相近的粒子。第二章 粒径检测:通过光学原理感知粒子的存在,可以从整体上对外泌体数量和直径的群体特征进行检测,但不能确认外泌体的真实存在和外泌体的完整性,不适用于复杂样品的检测。第三章 Western Blot 检测:采用抗原抗体特异性相结合的原理,可以鉴定外泌体中存在的特定蛋白,能证实外泌体成分的存在,无法确认外泌体的数量和完整性。上述任何单一的方法都难以精确鉴定,但可以通过三个实验相互佐证来确认外泌体的存在、数量和完整性。081.5 工程化赋能外泌体迄今为止,纯化的“天然”外泌体已在人体中显示出良好的安全性,但有时在临床试验中缺乏足够的功效。首先,这是
12、因为天然外泌体携带的作用性物质完全来源于分泌细胞;其次,外泌体在全身渗透的过程也并非无懈可击,进入体循环后,外泌体必须避开免疫细胞以及肝、肺、肾等排泄器官。同时它们的组织靶向效率也取决于功能化程度以及与靶细胞的相互作用强度。因此,科学家们正在设计工程化外泌体,以包含多种药物“货物”并特异性靶向不同的组织,由此衍生出了诸多工程化外泌体的构建策略。(工程化外泌体的表面修饰方式,图源:参考资料 6)(1)确定目标负载分子的包装方式确定负载分子的包装方式是指寻找将药物转入天然外泌体内部的方法,以保证药物的有效性和稳定性。这些方法通常被分为两大类:外源性加载和内源性加载。外源性加载:09先将外泌体分离纯
13、化,然后将现有药物(如 siRNA 和小分子)通过主动或者被动结合方式直接加载到外泌体中。其中被动结合主要通过浓度梯度差将药物扩散到外泌体内,操作相对简单而且可以保持外泌体的形态,但装载效率较低;主动结合方式需要暂时破坏细胞膜,使药物更容易进入外泌体的内部。在药物扩散后,外泌体的膜重新恢复,具体方法包括:电穿孔法、超声方法、挤压法、冻融法、化学转染等。内源性加载:这种方式是让生产外泌体的细胞也生产所需的药物,通过药物与大量表达的外泌体蛋白或其片段的遗传关联(例如在细胞内与 CD63 共表达将目标分子包装进外泌体)来实现加载,经修饰过的细胞分泌的外泌体便含有所需药物,最后再分离纯化。(2)外泌体
14、靶向改造目前在技术上已经有了许多更新的先进疗法,例如 RNA 干扰、mRNA、AAV 基因疗法和基因编辑平台,药物的设计不再是主要的限制因素,而是无法将它们递送到正确的细胞或位置。外泌体可以利用其来自不同细胞来源的归巢效应来靶向特定器官。然而,来自常用临床级细胞系(如 HEK293)的外泌体可能无法归巢于所需的靶器官。为了解决这个问题,可以通过将靶向部分工程化改造到囊泡上来,以改变外泌体的生物分布。通常会利用外泌体信号肽,将蛋白质导向到外泌体表面,以实现靶向性。LAMP-2B 即是一种常用于展示靶向基序的外泌体表面蛋白,它是溶酶体相关膜蛋白(LAMP)家族的成员,在细胞内主要定位于溶酶体和内涵
15、体,在外泌体表面也有大量表达。通过将靶分子和 LAMP-2B 进行融合,可将靶分子展示到外泌体膜表面。例如,表达与 LAMP-2B 融合的 整合素特异性 iRGD 肽(CRGDKGPDC)的外泌体能够将 KRAS siRNA 特异性递送至携带 v3 的非小细胞肺癌的 A549 肿瘤,从而导致KRAS 基因的敲低和肿瘤生长抑制。另一种 LAMP-2B-RVG(RVG 为一个神经特异性靶向肽),则可以通过同样的原理将外泌体导向到神经系统。除了 LAMP-2B 外,外泌体表面还有 CD63、CD9、CD81、GPI、PDGFRs 等结构提供丰富的想象空间。(3)人工合成外泌体由于细胞外囊泡的成分复杂
16、,对于它们如何调节细胞之间信息传递的具体机制所知甚少,人们在改造外泌体的途径中另辟蹊径,希望创造一种人工合成的外泌体可以模仿自然外泌10体的特性,并使之具有更特异的靶向性,以实现外泌体领域的“弯道超车”。在 Science Advances 上发表的一项研究中,海德堡马克斯普朗克医学研究所的研究人员带领的一支研究团队,根据对天然外泌体的详细分析,成功人工合成了外泌体,并且在试验中证实人工合成的外泌体能够调节和帮助伤口愈合以及有助于新血管形成。这是研究人员首次构建具有治疗功能的全人工合成外泌体,这一壮举无疑将进一步推动外泌体的发展。在这项研究中,研究人员从脂质微滴起步,加入在天然外泌体中存在的微
17、 RNA(miRNA),以及在外泌体表面存在的蛋白,构建了模拟天然外泌体的人工合成细胞外囊泡。与分离的天然外泌体相比,这一从头合成的技术让研究人员能够对外泌体的功能进行微调,从而创立一种可“编程”的外泌体合成技术。工程化外泌体表现出使其作为治疗药物载体的极具吸引力的关键特性,特别是它们能够靶向递送多种治疗性有效载荷的能力、良性安全性以及低免疫原性的潜力。然而针对外泌体特定应用的最佳分离方法、细胞外囊泡制剂的异质性以及合适方法和设备的可用性还需要大量的研究去验证,未来相关研究的披露将进一步激发国内外泌体领域的市场热情。userid:532115,docid:165554,date:2024-06
18、-24,11第二章 外泌体的应用趋势:从“细胞垃圾”到“明日之星”基于外泌体的特性,其在医疗领域有着非常广阔的应用前景,主要可以用于疾病诊断、疾病治疗、药物递送三大方向。(针对目标疾病的治疗和诊断中的外泌体应用相关的研究分布,图源:参考资料 1)2.1 诊断检测外泌体广泛存在于生物体液中,并携带多种包含生物信息的物质,使得其在疾病诊断上具有天然的优势,特别是在更高的诊断灵敏度和准确性方面。外泌体作为疾病诊断方式有着以下几个优点:首先,在疾病发展过程中外泌体的含量以及存在于其中的核酸、蛋白质、脂类等物质会发生改变,研究这些外泌体可以为了解组织的疾病状态提供一个窗口;其次,外泌体具有稳定性,即使在
19、复杂的肿瘤微环境中也可以抵抗降解,且其可以从尿液、血液、唾液甚至眼泪中分离出来,从而提供一种快速且非侵入性的诊断方法;12另外,与许多传统的血清生物标志物不同,外泌体可以通过血脑屏障,提供难以获取的脑细胞相关信息。目前,外泌体疾病诊断重点应用的方向包括心血管疾病、中枢神经系统疾病、癌症、传染性疾病和代谢疾病等。迄今为止,已经报道了多种用于诊断的标志物,如 GPC1(多糖磷脂酰肌醇聚糖-1)可以作为早期或晚期胰腺癌诊断的标志物;miR-125a-3p 可作为早期结直肠癌的诊断标志;miRNA 作为卵巢癌、骨髓瘤、早期结直肠癌等的诊断标志物等。国内企业中,汇芯生物聚焦尿液外泌体检测领域,开发泌尿系
20、统癌症早期筛查和泛癌种筛查产品,拥有前列腺癌、膀胱癌、肾癌以及泛癌种的检测试剂盒;亿航生物持续深耕外泌体诊断和再生医学领域,重点在肿瘤的早期诊断、动态监测和神经退行性疾病早期诊断;思路迪开发了针对卵巢癌的基于外泌体技术的体外诊断产品2.2 疾病治疗由于外泌体在多种生理过程中发挥重要作用,所以通过抑制外泌体的产生、增加外泌体的摄取、修饰外泌体等手段可以有效促进疾病的治疗。同时,外泌体还具有低致瘤性和低免疫原性的优势。目前,外泌体在疾病治疗的应用主要集中在肿瘤。RONG 等人研究发现,肿瘤细胞外泌体中的 TGF-可以抑制 T 细胞的增殖从而促使肿瘤细胞发生免疫逃逸,而抑制外泌体TGF-的表达后可增
21、强 T 细胞活性而达到抑制肿瘤转移的效果。另外,还有研究发现,外泌体可以通过激活线粒体依赖的凋亡通路来促进肿瘤细胞凋亡。所以,外泌体在肿瘤治疗中“亦正亦邪”,只有更深入地研究其机制,才能更好地利用其来抑制肿瘤。此外,外泌体还被广泛应用于治疗皮肤疾病、糖尿病、脏器损失修复、心血管疾病、神经系统疾病等领域。中科睿极与温州医科大学附属眼视光医院合作开展的临床研究项目“间充质干细胞外泌体治疗原发性干燥综合征相关性干眼的安全性及有效性研究”已经获得国家卫生健康委员会备案,是国内首个采用三维规模化技术制备外泌体进行干眼症治疗的临床研究。茵冠生物与广州呼吸健康研究院签订科研合作协议,将共同开展间充质干细胞来
22、源的外泌体治疗呼吸疾病的 IIT 研究。南医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科和血液内科,以及清华大学医学院常智杰教授团队在国内首次联合开展了间充质干细胞外泌体雾化吸入治疗肺纤维性病变的 IIT 研究2.3 药物递送13外泌体毒性小、免疫原性低、能穿透到机体深处,自诞生就是一位“超级快递员”。目前外泌体已被证明能够自然运输各种细胞代谢货物,例如蛋白类、核酸、小分子、基因治疗药物等。国内布局外泌体递送领域的企业数量较多,如唯思尔康在 2023 年宣布已经成功实现了外泌体递送小核酸的概念验证并发表了文章;亦诺微医药致力于开发外泌体载体,其管线涉及了多个非肿瘤疾病;呈诺医学已经构建完成外泌体合成工程
23、细胞株,建立了细胞外泌体基因递送技术平台(1)蛋白质递送蛋白多肽类药物具有药理活性高、针对性强、毒低等多方位的优势,但其体内稳定性差、易变性失活、生物膜渗透性差给其体内递送带来了许多难题。外泌体可通过基因编辑技术使细胞自组装带有外源蛋白的外泌体,使外泌体成为蛋白多肽类分子非常理想的递送载体。研究人员已经将外泌体递送蛋白类药物应用于多种疾病,且取得了诸多进展,但也面临着诸多挑战。外泌体先驱 Codiak BioSciences 曾经开发了两款外泌体产品 exoIL-12 和exoSTING 用于治疗肿瘤,两款产品使用 PTGFRN 和 BASP1 作为支架蛋白,将靶向配体或治疗分子安装到外泌体的
24、表面 PTGFRN 蛋白上或腔内 BASP1 蛋白上,达到运输至靶组织靶细胞和治疗疾病的作用。两款产品均进入了临床研发阶段,但都以失败而告终,其他外泌体递送蛋白类药物均处于临床前或者临床早期阶段,应用较多的疾病包括退行性疾病、心血管疾病、恶性肿瘤等。(2)核酸递送以外泌体为载体递送核酸是当下外泌体递送应用较多的领域之一,递送的核酸种类包括miRNA、siRNA、长非编码 RNA、circRNA 等,进展最快的产品已经进入临床。ExoASO-STAT6是Codiak BioSciences研发的一种工程化的外泌体精准药物候选药,此前已进入一期,该产品被设计为能够选择性地递送反义寡核苷酸以破坏肿瘤
25、相关巨噬细胞(TAM)中的STAT6 信号传导,并诱导抗肿瘤免疫反应。另外,外泌体递送核酸的临床前研究进展较多,也涌现出一些比较有特色的技术。2022 年12 月,一篇名为“Inhalable exosomes outperform liposomes as mRNA and protein drug carriers to the lung”的文章中报道了人肺球细胞来源的外泌体(Lung-Exo)在通过雾化吸入的方式将 mRNA 及蛋白质递送至肺部具有天然优势,并在肺组织中具有更好的滞留率,提高了mRNA 及蛋白质药物在肺组织中的生物利用度。2023 年 2 月发表的一篇名为“Enginee
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