液相色谱基础知识waters.pptx

液相色谱基础知识液相色谱基础知识色谱柱基础知识对对HPLC柱填料的了解柱填料的了解平均颗粒度，颗粒度分布.颗粒度(dp)颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差).颗粒分布颗粒分布越宽柱效低(渗透性差).颗粒形状球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型：柱床结构不均匀流动相线性速度不均匀谱带扩展对对HPLC柱填料的了解（二）柱填料的了解（二）平均孔径/孔体积孔径/孔体积分布.大的孔径可分析高分子量的分子对对HPLC柱填料的了解（三）柱填料的了解（三）键合相化学.影响化合物的分离度：a.不同键合相对不同种类的化合物分离不同.可能导致色谱的分离机理不同.如：C18、C8、CN硅胶表面及键合相硅胶表面及键合相键合相色谱柱键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点.固定相稳定，不易流失.应用广泛，可使用多种溶剂.消除硅羟基的不良影响缺点.pH值不能小于3.同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同对对HPLC柱填料的了解（四）柱填料的了解（四）含碳量含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加）.高含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好，重现性好有利于极性化合物的拖尾改善.低含碳量有利于分析中性及碱性化合物降低溶剂损耗不同色谱柱的含碳量不同色谱柱的含碳量 色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱C%C%k k苊苊苊苊(50/50(50/50的乙腈的乙腈的乙腈的乙腈/水水水水)Symmetry C181917Zorbax ODS1715.7LiChrosorb RP-181510.3Symmetry C81212.5Resolve C-181212.4Ultrasphere ODS1111.3Partisil ODS-31112.0Bondpak C-1810 7.9Nova-Pak C-18 7 5.5对对HPLC柱填料的了解柱填料的了解(五五)填料的端基封口.封口残余硅羟基.减少不可逆吸附或拖尾.增加碳含量（0.1%-1%）残基处理的效果残基处理的效果NovaPak C18未封口 C18 抗坏血酸 烟酰胺 对氨基苯甲酸 哌咯西叮 核黄素 苯酚 盐酸硫胺对对HPLC柱填料的了解（六）柱填料的了解（六）硅胶的活性.主要影响碱性化合物的保留行为：k.生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同.是选择性差异的主要来源硅胶的杂质含量.重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小.是色谱柱质量好坏的重要标志对对HPLC柱填料的了解（七）柱填料的了解（七）填料的稳定性.硅胶填料.pH：2-8聚合物填料.pH：2-12.pH值小于2时键合相水解填料基质物理性质的影响填料基质物理性质的影响所有C18柱都是相同的吗?填料基质的物理性质对色谱柱的影响.平均孔径及其分布影响被分析样品的分子量，大孔径的可分析高分子量样品.平均孔体积及其分布影响同孔径.含碳量影响化合物的保留时间，高含碳量保留时间长.填料的端基封口主要影响碱性化合物的峰形，未封口会使碱性化合物拖尾.硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为：K，高活性的K大.硅胶的杂质含量更苛刻条件下的碱性化合物峰形Waters色谱柱的内径色谱柱的内径分析柱：Waters Spherisorb及其它公司品牌的色谱柱多为4.6mm内径。Waters传统品牌的分析柱以3.9mm内径为主，比一般分析柱(4.6mm)细，因此：.相对灵敏度高.省溶剂，可用相对较低的流速.同样的流速下，柱压较高(高效柱尤为明显)注意在用文献方法时转换流速,即:降低流速,以保持线速度相同。色谱柱化学及外形结构的关系色谱柱化学及外形结构的关系对对HPLC柱的了解柱的了解理论塔板数(N),容量因子(K),选择性系数(),其影响因素有.N：受平均颗粒度及颗粒度分布的影响,颗 粒度越小,N越高.：受填料表面化学性质对色谱柱的影响,不同键合相对不同种类样品分离不同.K：受键合相表面含碳量的影响,含碳量高 时保留时间长在同样情况下保留行为也有差异在同样情况下保留行为也有差异因此：.需要对色谱化学品(色谱柱)有更多的了解.需要不同品牌，即各个因素有较大差异的色谱柱，以得到更多种选择性Waters拥有众多不同品牌的色谱柱，目的就是：供不同应用的要求用不同品牌的色谱柱时，色谱方法有时可能需要重新开发Waters各种硅胶基质的色谱柱各种硅胶基质的色谱柱Waters不同品牌的色谱柱不同品牌的色谱柱-BondaPak.文献背景强,是工业标准.平均孔径125，10m高活性、无定形硅胶.中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性Nova-Pak.平均孔径60，4m高韧度低活性球形硅胶.低酸性，高疏水性,极好的端基封口.有利于小分子物质的分析Waters不同品牌的色谱柱不同品牌的色谱柱Resolve.平均孔径90，5/10 m低活性硅胶.非常高的疏水性,无端基封口.有利于低保留的中性及酸性化合物分离Delta-Pak.有100和300两种孔径，5/15 m硅胶.中到高的疏水性，端基封口.适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱新一代硅胶基质的色谱柱新一代硅胶基质的色谱柱 Symmetry.高纯度硅胶：Fe,Al,Mg等均85%)2提取板及小柱可获得一致的回收率(RSDs5%)3容易使用Oasis HLB 固相提取小柱C18与Oasis HLB 吸附剂浸润能力的比较H L HLHLHLHLHLLLLLLLLL LLLL HLBH=亲水单元L=亲脂单元C18特征二，通用型吸附剂4优势:l在很宽极性范围内保留酸性、碱性及中性化合物l样品不会穿透小柱4益处:l对极性化合物可获得较高回收率l使用同一方法，提取药物及其极性代谢产物可获得高而重现性好的回收率l一种吸附剂适用于大多数SPE提取过程Oasis HLB固相提取小柱结果:通用型吸附剂020406080100AcidsNeutralsBases%回收率Ibuprofen(2.5?g)Naproxen(2?g)Salicylic Acid(5?g)Sulfadiazine(10?g)Sulfamerazine(10?g)Acetaminophen(0.5?g)Theobromine(0.5?g)Paraxanthine(0.5?g)Theophylline(0.5?g)Caffeine(0.5?g)Procainamide(0.5?g)Ranitidine(0.5?g)Oxycodone(1?g)Propranolol(4?g)Naltrexone(1?g)Salbutamol(2?g)Doxepin(4?g)Spiked Serum on 1 cc 30 mg Oasis?HLB CartridgesOasis小柱的使用方法小柱的使用方法 平衡/活化小柱1mL甲醇/1mL水上样可上200 mL样品清洗1mL5%甲醇/水洗脱1mL甲醇挥发并用流动相重组样品制备将样品用水稀释准备进样Oasis HLB：优化的提取方法Oasis HLB 固相提取小柱特征三，重现性Oasis HLB吸附剂填料在Waters ISO 9002-认可的工厂中生产 确保重现性.l 优势4每批吸附剂进行严格的质量控制，建立SPE填料重现性的新标准l 益处:4每盒产品附带合格证书4不同批次具有重现的回收率Oasis 不同批次间重现性Batch ABatch BBatch C 0.96%1.21%2.02%3.66%2.40%3.06%3.67%RSD020406080100%RecoveryProcainamideRanitidineAcetaminophenPropranololDP-phthalateDoxepinb-Methasone ValerateOasis HLB-应用各种药物提取，尤其是生理体液中的药物，如血浆、尿液中的药物等天然产物提取农业化学应用，如提取除草剂、杀虫剂等环境化学应用，如提取多环芳烃等色谱图常见问题色谱图常见问题色谱图常见问题主要有两类:.色谱峰峰形异常问题例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等.色谱峰保留时间问题保留时间不稳定等色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一)色谱峰峰形异常问题:.色谱图中未出峰:进样问题:未进样或样品分解流动相问题:泵未输液或流动相不正确检测器设置不正确,或检测器有问题.一个或几个峰是负峰流动相吸收本底高进样过程中进了空气离子对分离中的系统峰样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一)(续续)色谱峰峰形异常问题:.所有的峰均为负峰:信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒光学装置尚未达到平衡.所有的峰都是宽峰系统未平衡或未达到化学平衡溶样的溶剂比流动相强很多色谱柱类型或尺寸不正确色谱柱或保护柱被污染或降级温度变化对色谱柱的影响色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一)(续续)色谱峰峰形异常问题:.较早洗脱的峰呈宽峰进样体积过大或样品浓度太高进样器有问题,定量环(Loop)大小不合适在线过滤器,保护柱,色谱柱或管路堵塞管路问题:内径不对或切管不正确管路连接问题:接头或锥箍不正确检测器时间常数不正确色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一)(续续)色谱峰峰形异常问题:.峰比预想的要小样品粘度过大进样器有问题或进样体积有误检测器设置不正确,定量环(Loop)体积不正确检测器输出未置零用了不正确的检测器输出信号检测池被污染检测器的灯可能有问题色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一)(续续)色谱峰峰形异常问题:.双峰或肩峰进样量或样品浓度过大保护柱或色谱柱进口堵塞保护柱或色谱柱污染或失效.前伸峰进样量或样品浓度过大溶样的溶剂相对于流动相太强保护柱或色谱柱污染或失效色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(一一)(续续)色谱峰峰形异常问题:.拖尾峰保护柱或色谱柱问题:污染或失效进样问题检测器时间常数不正确.平头峰检测器设置不正确进样体积太大或样品浓度太高色谱峰保留时间问题:.保留时间飘忽不定(各次运行之间)系统不稳定或未达化学平衡泵压力不稳(泵头里有气泡)进样体积过大或样品浓度过大温度波动流动相混合不均匀色谱柱被污染色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(二二)色谱峰保留时间问题:.保留时间增加或减少(各次运行之间)系统不稳定或化学平衡不足泵流速变化温度变化色谱柱污染,柱效下降流动相被污染溶剂入口过滤器堵或管路堵塞系统渗漏色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(二二)(续续)色谱图常见问题分析色谱图常见问题分析(二二)(续续)色谱峰保留时间问题:.保留时间改变到一个新的恒定值流动相不正确或其组成不正确泵流速变化实际输液的流速不正确(泵失灵或故障)环境温度变化；柱温不正确色谱柱尺寸或类型不正确色谱柱被污染流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化输液系统的梯度滞后体积不正确HPLC常见问题常见问题系统压力问题.压力高.压力低或没有压力.压力不稳流路基线噪音问题.基线不稳定(不重复).长、短程振荡.基线漂移.噪音脉冲尖刺HPLC常见问题分析常见问题分析系统压力问题.压力高的原因温度太低流速太高流动相粘度大管路堵塞仪器或色谱柱堵塞压力传感器问题HPLC常见问题分析常见问题分析(续续)系统压力问题.压力低或没有压力温度太高;流速太低泵关闭或保险丝断了泵未输送流动相储液瓶中无溶剂低压限设置不当泵未正确排气溶剂入口过滤头堵入口管路中有空气泵失效系统内有渗漏处所用溶剂不正确自动进样器在Purge时卡住HPLC常见问题分析常见问题分析(续续)系统压力问题.压力不稳压力传感器问题泵排气不充分泵失效流动相未正确脱气所用溶剂不混溶或易挥发HPLC常见问题分析常见问题分析(续续)流路基线噪音问题.基线不稳定(不重复)检测池中有大的气泡流路中有小气泡流过系统未稳定或未达到化学平衡流动相被污染检测器流动池漏色谱柱污染HPLC常见问题分析常见问题分析(续续)流路基线噪音问题.基线漂移系统不稳或未化学平衡温度波动流动相未正确脱气流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化检测器流动池漏;系统中有渗漏色谱柱污染;固定相渗漏选用不正确的检测波长(相对于溶剂)有迟流出的组分HPLC常见问题分析常见问题分析(续续)流路基线噪音问题.短程振荡泵压不稳泵入口管松,弯或堵塞溶剂混合不充分检测池中有大气泡泵入口阀脏或失效泵柱塞杆密封垫磨损检测器出口溶液成滴状流入废液瓶HPLC常见问题分析常见问题分析(续续)流路基线噪音问题.长程振荡温度波动溶剂被循环通过系统.噪音脉冲尖刺流路中有小气泡泵头有气泡空腔入口阀脏或失效检测池中有小颗粒物泵或检测器未正确接地判断故障与故障排除的原则判断故障与故障排除的原则规则一确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复 出现，很难证实其确实存在。规则二一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因 素与问题之间的关联。规则三恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题 之所在,完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则,换下的组件将来很难再利用,会造成浪费。规则四尝试预测将来可能发生的问题。利用成功的故 障排除经验来改善您目前的预防保养工作,使现有 问题再发率降至最低。规则五养成记录的好习惯。一个好记录是成功地进行 故障排除的关键。