猪IFNIL的克隆与表达.pptx

报告人：陆金成 导师：马静云副教授1、细胞因子介绍2、实验方案3、实验进展4、研究进展细胞因子（cytokine,CK）由免疫系统细胞以及其他类型细胞主动分泌的一类小分子量的可溶性蛋白质。包括淋巴因子、干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋势化因子和集落刺激因子等。是免疫系统细胞间，以及免疫系统细胞与其他类型细胞间联络的核心，能改变分泌细胞自身或其他细胞的行为或性质，通过与细胞特异的膜受体而起作用。在nmol/L或pmol/L水平即显示生物学作用。干扰素（interferon,IFN)1957年发现的细胞因子，最初发现某一种病毒感染的细胞能产生一种物质可干扰另一种病毒的感染和复制，因此而得名。根据干扰素产生的来源和结构不同，可分为IFN-、IFN-和IFN-，他们分别由白细胞、成纤维细胞和活化T细胞所产生。型干扰素（IFN-）：（1）抗病毒、抗肿瘤作用：诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒复制，抑制病毒感染或扩散；增强NK细胞和CTL细胞对病毒感染细胞和肿瘤细胞的杀伤破坏作用。（2）免疫调节作用：型干扰素比较弱。型干扰素（IFN-和IFN-）：（1）抗病毒、抗肿瘤作用与型干扰素的类似，但作用较弱；（2）免疫调节作用：激活单核-巨噬细胞；促MHC I 类和MHC 类分子的表达，增强NK细胞和CTL细胞的杀伤活性；抑制Th0细胞向Th2细胞转化；促T细胞和B细胞分化、增殖。白细胞介素（interleukin,IL)1979年开始命名。由淋巴细胞、单核细胞或其它非单个核细胞产生的细胞因子，在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用。1.白细胞介素-1（IL-1）：有两种存在形式，即IL-1和IL-1，结合相同受体。细胞来源：主要为单核吞噬细胞，还有淋巴细胞、内皮细胞及角化细胞等。主要生物学功能：（1）低浓度时主要具有免疫调节作用，如协同刺激增强T细胞和APC活性；促B细胞增殖及抗体产生。（2）高浓度时诱发肝急性期血浆蛋白合成，介导炎症反应；引起发热和恶病质状态。2.白细胞介素-2（IL-2）细胞来源：主要由CD4+T细胞产生，CD8+T细胞也可产生。以自分泌和旁分泌方式发挥效应。主要生物学功能：（1）活化CD4+和CD8+T细胞，促细胞因子产生；（2）刺激NK细胞增殖、活化，诱导LAK细胞产生；（3）促活化B细胞增殖及产生抗体；（4）可激活单核-巨噬细胞。3.白细胞介素-4（IL-4）细胞来源：主要由Th2细胞产生。主要生物学功能：（1）刺激B细胞活化、增殖，诱导Ig类别转换产生IgG和IgE，并促进其抗原递呈；（2）促进Th0细胞向Th2细胞分化；（3）抑制Th1细胞活化、增殖；（4）协同IL-3刺激肥大细胞增殖。4白细胞介素-6（IL-6）细胞来源：主要由Th2细胞产生，也可由单核-巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生。主要生物学功能：（1）刺激肝细胞合成急性期血浆蛋白，参与炎症反应；（2）刺激活化细胞的增殖，分泌抗体；（3）协同刺激细胞、胸腺细胞和骨髓造血干细胞增殖；（4）促骨髓瘤细胞增殖。5白细胞介素-8（IL-8）细胞来源：主要由单核-巨噬细胞和内皮细胞产生，也可由上皮细胞和成纤维细胞产生。主要生物学功能：（1）对中性粒细胞有强的趋化作用，对嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞也有趋化作用；（2）活化中性粒细胞，参与炎症反应。6白细胞介素-10（IL-10）细胞来源：主要由Th2细胞和单核巨噬细胞产生；细胞和上皮细胞也可产生。主要生物学功能：（1）抑制巨噬细胞的抗原递呈和辅助T细胞应答功能；（2）抑制Th0细胞向Th1细胞分化及细胞因子产生；（3）可促B细胞分化增殖。7白细胞介素-12（IL-12）细胞来源：主要由T细胞、B细胞、单核-巨噬细胞产生。主要生物学功能：（1）激活NK细胞；（2）促Th0细胞向Th1细胞分化、增殖；（3）刺激CD8+CTL细胞活化；（4）可协同IL-2诱生LAK细胞。8白细胞介素-18（IL-18）细胞来源：单核-巨噬细胞和上皮细胞。主要生物学功能：（1）刺激活化T细胞产生细胞因子；（2）诱导NK细胞的细胞毒作用。1、根据NCBI/GenBank 上登载的猪IL-2(AF191088)、IL-4(AY294020)、IL-6(M80258)、IL-18(AF191088)和 INF-(GQ415073)、INF-(AY188090)基因序列，在其阅读框两侧用Primer 5.0和Oligo 6软件分别设计5对引物:IL-2 Up 5CCTCAACTCCTGCCACAATGTAT 3 Down 5TCAAGTCAGTGTTGAGTAG 3IL-4 Up 5 ATGGGTGTCACCTCCCAACTG3 Down 5AGATTCAACACTTTGAGTAT3IL-6 Up 5CCAGGAACCCAGCTATGAACT3 Down 5GCCCCAGCTACATTATCC3IL-18 Up 5 ATGGCTGCTGAACCGGAAGAC3 Down5CTAGTTCTTGTTTTGAACAGTGAACA3INF-Up 5 ATGGCTAACAAGTGCATCC3 Down 5TCAGTTCCGGAGGTAATC3INF-Up 5 TCCGAAACAATGAGTTAT3 Down 5CAATTATTTTGATGCTCTCT32、无菌采取猪外周血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞（PBMC），对猪 PBMC用含植物血凝素PHA（2 gml-1）+脂多糖LPS（5 gml-1）的RPMI1640培养刺激诱导10 h后收集细胞3、取上述细胞用TRIzol Reagent提取提取总RNA4、RTPCR（TaKaRa One Step RNA PCR Kit）扩增猪IL-2、IL-4、IL-6、IL-18和 INF、INF基因，PCR产物经回收，连接pGEMT载体，转化DH5，筛选，接种含Amp的LB，37 220 rrain振摇过夜，提取质粒，PCR鉴定后，测序5、依据猪IL-2、IL-4、IL-6、IL-18 和 INF-、INF-基因序列，重新设计表达型特异性引物，在引物两端加酶切位点，连接表达型载体，选用合适工程菌表达。M：DL2000，：IFN-引物跨幅561bpM：DL2000，1、2、3、4：阳性样品IFN-菌液鉴定M：DL2000，5、6：IL6；7、8：IL18；9、10：IFN-IL6引物跨幅660bp IL18引物跨幅579bp IFN-引物跨幅561bpIL6、IL18菌液鉴定M：DL2000，1、2：IL6阳性样品4、5、6：IL18阳性样品；李春华等,选用的大肠埃希菌表达质粒pET32a，成功以包涵体形式表达猪重组IL-2 蛋白（2010,26(1):5-8上海农业学报）陈院，采用巴斯德毕赤酵母的分泌表达方式，成功表达猪IL-2 成熟蛋白（2010.12中国畜禽种业）宋世斌等，完成了IL-18 在毕赤酵母中的表达,在此基础上从发酵时间、不同诱导型、p H 值、诱导剂量和接种量等方面对重组基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化,进一步探索了酵母菌表达猪IL-18 的发酵工艺。（2008 年2 月第1 期38 42，甘肃农业大学学报）周强等，建立了小鼠白细胞介素-12乳酸菌基因表达系统。在nisin 的诱导下,NZ9000能够产生并分泌白细胞介素-12约80 ng/L（2007,27(3)，徐州医学院学报）杨永胜等，扩增出poIFN-1 全基因，将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1 中，构建重组表达载体pGEX-6P-poIFN1，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行蛋白诱导表达和鉴定。（2010,26(11):1-6中国农学通报）李林等，克隆并表达了猪IFN-基因。转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,得到高效表达。（2010,37(1):32-35安徽农业大学学报）张瑞华等，根据-poIFN 的结构,利用基因工程手段将-poIFN的信号肽缺失掉,采用pGEX-KG 载体表达缺失信号肽的-poIFN基因,结果表明,PGE-KG/BL21 中获得较高表达。（2010 年(第46 卷)第12 期，中国兽医杂志）梁望旺等，利用基因工程手段，猪 干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达，并具有免疫活性。（2010 年11 月，湖北农业科学）朱艳平等，通过小量发酵、摇瓶发酵、大量发酵,研究猪-IFN 在毕赤酵母中表达的下游工艺,微量细胞板法测猪-IFN体外抗VSV、PRRSV、TGEV 的活性。（2010 年4 月，中国兽医学报）