猪心去蛋白提取物原液.pptx

猪心去蛋白提取物原液结构主要组成成分研究摘 要本实验所用样品为猪心去蛋白质提取物原液，其成品应用于医疗领域。实验主要是对此原液进行结构确证，即主要组成成分研究。初步分析本品中可能含有的三类生化物质是蛋白质，核酸，糖类。表明本品主要成分为蛋白质类。因此，本实验采用以下几种颜色反应，即茚三酮反应，双缩尿反应，二苯胺反应，地衣酚反应和蒽酮反应分别对蛋白质类物质，肽类物质，DNA结构物质，RNA结构物质以及糖类物质等进行鉴定，以便确定此样品中是否含有这些成分。之后用紫外吸收分析法来测定样品的最大吸收波长，若在蛋白质类物质的吸收范围内则可进一步确定了本品的主要组成成分为蛋白质类物质。然后是对样品中多肽含量的定量分析。我们采用双缩尿分析法，通过制作标准曲线和测出样品溶液的吸光值从而计算出样品的多肽含量。此外，我们还要对样品中的主要成分的分子量的大小进行测定。本实验主要应用两种方法以便进行对比。先采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，通过计算本品的组分分子的有效迁移率并制作标准曲线，即可测出各组分分子的分子量大小。另一种方法是用排阻高效液相色谱分析法，通过面积归一法计算峰面积可得出样品主要成分的分子量。关键词颜色反应；紫外扫描光谱分析；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；排阻高效液相色谱分析；序 言 注射用猪心去蛋白提取物为以健康猪心脏为原料，通过现代生物技术手段制备的小分子多肽类物质。具有改善心肌供血状况及心脏功能，增加心肌利用氧，促进机体代谢，保护细胞，修复受损的内皮细胞，恢复心肌细胞功能，改善心血管再灌注损伤及血液循环障碍等作用。本试验的目的是对制成此药品的猪心细胞原液进行结构确证。通过颜色反应分析、紫外扫描分析、SDS-PAGE分析、排阻高效液相色谱分析及组分含量分析等方法对本品原液的化学结构或组分进行了研究，确证了本品原液的主要组成成分为蛋白质类，即多肽和氨基酸。实验步骤一、提取过程二、颜色反应分析三、紫外吸收分析四、样品多肽含量分析五、SDS-聚丙烯酰胺电泳分析六、排阻高效液相色谱分析一、提取过程 材料处理:取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞碎。提取:称取绞碎猪心肌肉500克，放人2000m1烧杯中，加蒸馏水1000ml，在电动搅拌器搅拌下以2M H2S04调pH至4.0(此时溶液呈暗紫色)，在室温下搅拌提取2小时，在提取过程，使抽提液的pH值保持在4.0左右。在即将提取完毕，停止搅拌之前，以1M NH40H调pH至6.0，停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤液。滤渣加入750m1蒸馏水，再按上述条件提取1小时，两次提取液合并。中和:用1M NH40H调上述提取液至pH 7.2(此时，等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来)，静置3040分钟中后过滤，所得滤液 实验过程（1）茚三酮反应 茚三酮反应是指在PH5-7之间,茚三酮与-氨基酸、蛋白质以及蛋白质衍生物反应产生一种紫色的化合物.一级胺和氨也能给出阳性反应,但没有CO2气体放出，亚氨基酸、脯氨酸和羟脯氨酸也与茚三酮反应，但产生黄色的复合物。茚三酮反应十分灵敏，控制合适的反应条件，可用于氨基酸的定性和定量分析。5 方法：向试管中加样品溶液1.0ml，滴加茚三酮试液3-5滴，微热，如含有蛋白质类物质，溶液应显蓝紫色。（2）双缩脲反应 双缩脲反应是将尿素加热，2分子尿素缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）在碱性溶液中Cu2+结合（4：1）成粉红色的化合物。颜色的深浅与蛋白质含量成正比，故可用于比色法测定蛋白质的含量。2 双缩脲反应可用于检查蛋白质的水解程度，当蛋白质水解液不产生双缩脲反应时，可以认为水解液中只有氨基酸和二肽存在，蛋白质的水解是完全的。方法：取本品原液1.5ml，加6%氢氧化钠1.5ml，加双缩脲试液0.15ml，如含有肽结构物质，溶液蓝色应变深。方法：取本品原液1.5ml，加6%氢氧化钠1.5ml，加双缩脲试液0.15ml，如含有肽结构物质，溶液蓝色应变深。（3）二苯胺反应 二苯胺反应是在酸性条件下，DNA与二苯胺试剂反应产生一种蓝色的复合物，在595nm下具有强烈的吸收。蓝色的化合物的产生是由于脱氧核糖的存在。在酸性溶液中，脱氧核糖转变为-羟基-酮基戊醛；后者与二苯胺缩合形成了有色化合物，在580-600nm波长下具有最大的光吸收。DNA分子中含有脱氧核糖，所以也能与二苯胺试剂反应显示出特征的颜色。实验结果表明，在一定的浓度范围内，所成的颜色的深浅与DNA的量之间有线性关系。因此，可以利用比色法测定样品中的DNA的含量。5 方法：向试管中加入原液1.0ml，加二苯胺试液1.0ml，沸水浴10分钟，如含有DNA结构的物质，溶液显蓝色。（4）地衣酚反应 地衣酚反应此反应是用来鉴定RNA的颜色反应。在RNA的提取液中加入地衣酚试剂，沸水浴中煮沸20分钟，产生蓝绿色的化合物。2这是因为核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，而后者与3，5-二羟基甲醛（地衣酚）反应呈鲜绿色，步骤1：取本品原液1.0ml，加地衣酚试液1.0ml，沸水浴20分钟，观察。步骤2：核酸浓缩法步骤3：取沉淀溶解，对溶解液再进行地衣酚显色反应，观察颜色变化，如含有RNA结构物质，溶液显鲜绿色。（5）蒽酮反应 蒽酮反应是一种比较常用的用于对溶液中的糖类物质进行鉴定的颜色反应。当蒽酮与糖类物质发生反应是溶液将呈现出鲜绿色。此反应也可通过比色法对糖进行定性分析。5方法：取原液1.0ml，加蒽酮试液1.0ml，沸水浴10分钟，如含有糖类物质，溶液显蓝绿色。实验结果 组数 茚三酮 双缩脲 二苯胺 地衣酚（1）地衣酚（2）蒽酮 第一组 正反应 正反应 负反应 正反应 负反应 极微反应 第二组 正反应 正反应 负反应 正反应 负反应 极微反应 第三组 正反应 正反应 负反应 正反应 负反应 极微反应二、紫外吸收分析 本实验是通过对样品溶液在200-400nm范围内进行扫描，看此样品的最大吸收是否在蛋白质类物质的吸收范围内的定性分析，来鉴定本样品中是否含有蛋白质类物质。将本品原液用纯化水适当稀释后，分别加入纯化水、乙醇、0.1mol/L氢氧化钠等作为样品原液的溶剂，放入分析仪，在200-400nm范围内扫描。仪器显示屏上的最终结果是：样品的最大吸收波长在250nm附近，这在蛋白质类物质的吸收范围之内；酸性溶液中的紫外吸收光谱无太大变化；碱性溶液中发生偏移，此为蛋白质类物质的特性。以上结果进一步证明样品中的主要成分为蛋白质类物质。三、样品多肽含量分析 双缩尿法测蛋白含量的原理是蛋白质有两个以上的肽键（-CO-NH-），因此有双缩尿反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围1-10mg蛋白。双缩脲标准曲线比色液用量表试剂试管编号1234567标准蛋白（ml）00.150.30.60.91.21.5水（ml）1.51.351.20.90.60.30NaOH（ml）1.51.51.51.51.51.51.5双缩脲（ml）0.150.150.150.150.150.150.15蛋白含量（g）015330661291812241630吸光值A00.1830.2140.3740.5840.7310.912制作标准曲线，之后取原液2ml，稀释5倍后，取稀释液1.5ml，可从标准曲线上查得样品浓度。最终测得样品含量为750g，吸光值为0.458。用以下公式计算：多肽含量（g/ml）=X（g）稀释倍数 样品检测液体积 =7505/1.5 =2500g/ml=2.5mg/ml 最终的坐标曲线如图 四、SDS-聚丙烯酰胺电泳分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳是由一定量的单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在加速剂和催化剂共同作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶，以这种凝胶为支持物进行的电泳就称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂盛大，SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，他们在水溶液中的形状，近似于长椭圆棒。不同的蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。蛋白质的分子量与电泳相对迁移率之间的关系是：Mr=K(10-bRm)logMr=logK-bRm式中 Rm=样品迁移率/染料迁移率（cm）Mr-蛋白质的分子量；logK-截距；b-斜率；Rm-相对迁移率。在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白质的相对相对迁移率可从标准曲线上求得它的分子量。SDS-不连续系统不同浓度凝胶配置用量表试剂名称16%的分离胶/ml3%的浓缩胶/ml浓缩胶缓冲液01.25分离胶缓冲液7.50凝胶储备液1611%TEMED22蒸馏水4.35.5510%AP0.20.2标准品分子量对数对电泳迁移率图 实验过程（1）装板（2）配胶（3）上胶（4）样品制备，标准品制备（6）加样，电泳，固定、染色、脱色（7）制作标准品分子量对数对电泳迁移率图 最终测得的供试品迁移率为0.45，经计算得出的样品分子量约为6000Da。五、排阻高效液相色谱分析 排阻高效液相色谱分析是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。色谱条件检测波长：250nm柱 温：35流 速：0.8ml/min流动相：0.2mol/l的PH6.8的磷酸盐缓冲液计算结果 实验采用面积归一化法计算保留时间小于胰岛素（分子量在5800Da）的峰占总峰面积的百分含量。保留时间小于胰岛素的可视为大分子。实验结果显示样品出峰时间相近，各峰面积比例相近，分子量分布主要在5800Da以下.六、结论与讨论1实验结论 本实验的结论为：本品经颜色反应，确定了样品中含有蛋白质类物质，肽类结构物质，无DNA结构的物质，不含有RNA结构的物质，含有极微量的糖类物质。后用紫外吸收分析进一步证实了样品溶液中的主要成分为蛋白质类物质并对溶液中的多肽含量进行了定量分析，结果为2.5mg/ml左右。最后通过SDS电泳和液相色谱分析，得知样品的主要成分的分子量在6000Da以下。2结果讨论 在颜色反应分析中，通过地衣酚反应验证样品中是否有RNA类物质时，若样品未经处理，反应的结果是呈鲜绿色的，但这里要注意，因为地衣酚反应的特意性较差，凡是戊糖均有此反应，而其他杂质也能给出类似的颜色。4这里可能是蛋白质类物质有干扰，所以本实验采用核酸提纯浓缩法（冰乙醇法），对本品处理，因为乙醇可以沉淀出大分子物质如RNA或多糖类物质，而其他类物质可以留在溶液中。5这样，对沉淀分析就可以知道样品中到底有无RNA类物质。在SDS跑电泳分析中，实验采用了一种AP-TEMED催化体系。TEMED是一种脂肪族叔胺，它的碱基可以催化AP（过硫酸铵）水解液产生游离氧原子，后者激活Acr单体，形成单体长链，在交联剂Bis作用下聚合成凝胶。该反应在碱性条件下，聚合速度与AP浓度的平方根成正比。一般在室温，PH8.8时，7.5%的丙烯酰胺溶液30min完成聚合反应，但在PH4.3时，大约需要90min才能完成。此外，要选择高纯度的Acr和Bis单体，杂质、某些金属离子、低温和氧气分子都能延长或者阻止碳链的延长和聚合反应。化学聚合法生成的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，而且各次制备具有很好的重要性。胶的弹性、孔径大小、透明度等与凝胶总浓度（T）和Acr与Bis之间的量比的关系：T（%）=（a+b）/m*100式中 m-所用的缓冲液的体积，ml a-Acr的量，g b-Bis的量，g 交联剂百分比C（%）=b/（a+b）*100 当Acr和交联剂Bis的比值小于10时，制成的凝胶脆而易碎，坚硬呈白色。一般来说，Acr和Bis的比值在30左右时,可制成的凝胶透明而具有弹性。当T在5%-20%的范围内时，可使用经验公式：C=6.5-0.3T 来选择交联剂百分比的大小。T和C不仅与凝胶的机械性能有关，还与凝胶的孔径大小有关。一般来说，T大，制成的凝胶的孔径小，反之，制成的凝胶的孔径就大。在实际工作中，可根据被分离物分子量的大小而选择所需凝胶的浓度范围。5 排阻高效液相色谱的对仪器的一般要求是色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定.凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升，除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。在用紫外吸收检测器时,所用流动相应符合紫外分光光度法项下的对溶剂的要求。各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变,以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。测定供试品（或经衍生化处理的供试品）中各杂质及杂质的总量限度采用不加校正因子的峰面积归一法。计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率。但溶剂峰不计算在内。色谱图的记录时间应根据各品种所含杂质的保留时间决定，除另有规定外,可为该品种项下主成分保留时间的倍数。在进行色谱分析时，采用的分析纯试剂须进一步纯化以除区有干扰的杂质。而且在色谱柱整个使用期间，溶剂不纯，则长期积累杂质而影响收集的馏分纯度。本实验在作分析前对所有的试剂溶液都进行了超滤处理。