猪心去蛋白提取物原液.pptx
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1、猪心去蛋白提取物原液结构主要组成成分研究摘 要本实验所用样品为猪心去蛋白质提取物原液,其成品应用于医疗领域。实验主要是对此原液进行结构确证,即主要组成成分研究。初步分析本品中可能含有的三类生化物质是蛋白质,核酸,糖类。表明本品主要成分为蛋白质类。因此,本实验采用以下几种颜色反应,即茚三酮反应,双缩尿反应,二苯胺反应,地衣酚反应和蒽酮反应分别对蛋白质类物质,肽类物质,DNA结构物质,RNA结构物质以及糖类物质等进行鉴定,以便确定此样品中是否含有这些成分。之后用紫外吸收分析法来测定样品的最大吸收波长,若在蛋白质类物质的吸收范围内则可进一步确定了本品的主要组成成分为蛋白质类物质。然后是对样品中多肽含
2、量的定量分析。我们采用双缩尿分析法,通过制作标准曲线和测出样品溶液的吸光值从而计算出样品的多肽含量。此外,我们还要对样品中的主要成分的分子量的大小进行测定。本实验主要应用两种方法以便进行对比。先采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,通过计算本品的组分分子的有效迁移率并制作标准曲线,即可测出各组分分子的分子量大小。另一种方法是用排阻高效液相色谱分析法,通过面积归一法计算峰面积可得出样品主要成分的分子量。关键词颜色反应;紫外扫描光谱分析;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析;排阻高效液相色谱分析;序 言 注射用猪心去蛋白提取物为以健康猪心脏为原料,通过现代生物技术手段制备的小分子多肽类物质。具有改善心肌供血
3、状况及心脏功能,增加心肌利用氧,促进机体代谢,保护细胞,修复受损的内皮细胞,恢复心肌细胞功能,改善心血管再灌注损伤及血液循环障碍等作用。本试验的目的是对制成此药品的猪心细胞原液进行结构确证。通过颜色反应分析、紫外扫描分析、SDS-PAGE分析、排阻高效液相色谱分析及组分含量分析等方法对本品原液的化学结构或组分进行了研究,确证了本品原液的主要组成成分为蛋白质类,即多肽和氨基酸。实验步骤一、提取过程二、颜色反应分析三、紫外吸收分析四、样品多肽含量分析五、SDS-聚丙烯酰胺电泳分析六、排阻高效液相色谱分析一、提取过程 材料处理:取新鲜或冰冻猪心,除去脂肪和韧带,用水洗去积血,将猪心切成小块,放入绞肉
4、机绞碎。提取:称取绞碎猪心肌肉500克,放人2000m1烧杯中,加蒸馏水1000ml,在电动搅拌器搅拌下以2M H2S04调pH至4.0(此时溶液呈暗紫色),在室温下搅拌提取2小时,在提取过程,使抽提液的pH值保持在4.0左右。在即将提取完毕,停止搅拌之前,以1M NH40H调pH至6.0,停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤,收集滤液。滤渣加入750m1蒸馏水,再按上述条件提取1小时,两次提取液合并。中和:用1M NH40H调上述提取液至pH 7.2(此时,等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小,从溶液中沉淀下来),静置3040分钟中后过滤,所得滤液 实验过程(1)茚三酮反应 茚三酮反应是指在PH
5、5-7之间,茚三酮与-氨基酸、蛋白质以及蛋白质衍生物反应产生一种紫色的化合物.一级胺和氨也能给出阳性反应,但没有CO2气体放出,亚氨基酸、脯氨酸和羟脯氨酸也与茚三酮反应,但产生黄色的复合物。茚三酮反应十分灵敏,控制合适的反应条件,可用于氨基酸的定性和定量分析。5 方法:向试管中加样品溶液1.0ml,滴加茚三酮试液3-5滴,微热,如含有蛋白质类物质,溶液应显蓝紫色。(2)双缩脲反应 双缩脲反应是将尿素加热,2分子尿素缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中Cu2+结合(4:1)成粉红色的化合物。颜色的深浅与蛋白质含量成正比,故可用于比色法测定蛋白质的含
6、量。2 双缩脲反应可用于检查蛋白质的水解程度,当蛋白质水解液不产生双缩脲反应时,可以认为水解液中只有氨基酸和二肽存在,蛋白质的水解是完全的。方法:取本品原液1.5ml,加6%氢氧化钠1.5ml,加双缩脲试液0.15ml,如含有肽结构物质,溶液蓝色应变深。方法:取本品原液1.5ml,加6%氢氧化钠1.5ml,加双缩脲试液0.15ml,如含有肽结构物质,溶液蓝色应变深。(3)二苯胺反应 二苯胺反应是在酸性条件下,DNA与二苯胺试剂反应产生一种蓝色的复合物,在595nm下具有强烈的吸收。蓝色的化合物的产生是由于脱氧核糖的存在。在酸性溶液中,脱氧核糖转变为-羟基-酮基戊醛;后者与二苯胺缩合形成了有色化
7、合物,在580-600nm波长下具有最大的光吸收。DNA分子中含有脱氧核糖,所以也能与二苯胺试剂反应显示出特征的颜色。实验结果表明,在一定的浓度范围内,所成的颜色的深浅与DNA的量之间有线性关系。因此,可以利用比色法测定样品中的DNA的含量。5 方法:向试管中加入原液1.0ml,加二苯胺试液1.0ml,沸水浴10分钟,如含有DNA结构的物质,溶液显蓝色。(4)地衣酚反应 地衣酚反应此反应是用来鉴定RNA的颜色反应。在RNA的提取液中加入地衣酚试剂,沸水浴中煮沸20分钟,产生蓝绿色的化合物。2这是因为核糖核酸与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糠醛,而后者与3,5-二羟基甲醛(地衣酚
8、)反应呈鲜绿色,步骤1:取本品原液1.0ml,加地衣酚试液1.0ml,沸水浴20分钟,观察。步骤2:核酸浓缩法步骤3:取沉淀溶解,对溶解液再进行地衣酚显色反应,观察颜色变化,如含有RNA结构物质,溶液显鲜绿色。(5)蒽酮反应 蒽酮反应是一种比较常用的用于对溶液中的糖类物质进行鉴定的颜色反应。当蒽酮与糖类物质发生反应是溶液将呈现出鲜绿色。此反应也可通过比色法对糖进行定性分析。5方法:取原液1.0ml,加蒽酮试液1.0ml,沸水浴10分钟,如含有糖类物质,溶液显蓝绿色。实验结果 组数 茚三酮 双缩脲 二苯胺 地衣酚(1)地衣酚(2)蒽酮 第一组 正反应 正反应 负反应 正反应 负反应 极微反应 第
9、二组 正反应 正反应 负反应 正反应 负反应 极微反应 第三组 正反应 正反应 负反应 正反应 负反应 极微反应二、紫外吸收分析 本实验是通过对样品溶液在200-400nm范围内进行扫描,看此样品的最大吸收是否在蛋白质类物质的吸收范围内的定性分析,来鉴定本样品中是否含有蛋白质类物质。将本品原液用纯化水适当稀释后,分别加入纯化水、乙醇、0.1mol/L氢氧化钠等作为样品原液的溶剂,放入分析仪,在200-400nm范围内扫描。仪器显示屏上的最终结果是:样品的最大吸收波长在250nm附近,这在蛋白质类物质的吸收范围之内;酸性溶液中的紫外吸收光谱无太大变化;碱性溶液中发生偏移,此为蛋白质类物质的特性。
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