猪血清IgG的分离纯化及鉴定.pptx

1Contents材料与方法结果与讨论总结与感想2一、材料与方法一、材料与方法（一）试验材料（一）试验材料1 1、供试材料、供试材料 采用猪血为实验材料，采自宁波方兴食品有限公司采用猪血为实验材料，采自宁波方兴食品有限公司屠宰场。收集健康肉猪颈动脉血液，室温下放置屠宰场。收集健康肉猪颈动脉血液，室温下放置1-2h，析出血清，于析出血清，于4、8000r/min离心离心10min，除去血球和，除去血球和纤维蛋白原后，取上层血清，纤维蛋白原后，取上层血清，-20冰箱内保存备用。冰箱内保存备用。32 2、主要试剂、主要试剂 试剂名称试剂名称规格规格出产厂家出产厂家三氯醋酸三氯醋酸正辛酸正辛酸氯化钠氯化钠氢氧化钠氢氧化钠盐酸盐酸TrisTris无水乙醇无水乙醇醋酸醋酸分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯上海光铧科技有限公司上海光铧科技有限公司衢州巨化试剂有限公司衢州巨化试剂有限公司天津市永大化学试剂开发中心天津市永大化学试剂开发中心上海三鹰化学试剂有限公司上海三鹰化学试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司杭州瓶窑和顺化工试剂厂杭州瓶窑和顺化工试剂厂浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司4试剂名称试剂名称规格规格出产厂家出产厂家考马斯亮蓝考马斯亮蓝甘油甘油巯基乙醇巯基乙醇SDSSDS甘氨酸甘氨酸溴酚蓝溴酚蓝DEAE52DEAE52过硫酸铵过硫酸铵乙酸钡分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司无锡市龙吉化工试剂有限公司无锡市龙吉化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司上海源聚生物科技有限公司上海源聚生物科技有限公司天津市永大化学试剂开发中心天津市永大化学试剂开发中心浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司安徽三星树脂科技有限公司安徽三星树脂科技有限公司上海三鹰化学试剂有限公司上海三鹰化学试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司浙江中星化工试剂有限公司53 3、仪器设备、仪器设备 仪器名称仪器名称型号型号生产厂家生产厂家紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计S52S52恒达仪器厂恒达仪器厂电泳仪电泳仪CS101CS101上海精密科学仪器有限公司上海精密科学仪器有限公司低速大容量离心机低速大容量离心机TDL-5TDL-5上海安亭科学仪器厂上海安亭科学仪器厂高速万能粉碎机高速万能粉碎机FW100FW100天津市泰斯特仪器有限公司天津市泰斯特仪器有限公司数显恒温水浴锅数显恒温水浴锅HH-2HH-2常州国华电器有限公司常州国华电器有限公司真空干燥箱真空干燥箱DZF-6050DZF-6050上海一恒科技有限公司上海一恒科技有限公司电子精密天平电子精密天平AB-LAB-L梅特勒托利多仪器有限公司梅特勒托利多仪器有限公司全温振荡（空气）培养箱全温振荡（空气）培养箱QYC-211QYC-211上海福玛实验设备有限公司上海福玛实验设备有限公司自动液相色谱分离层析仪自动液相色谱分离层析仪MC99-3MC99-3上海沪西分析仪器厂上海沪西分析仪器厂电热恒温鼓风干燥箱电热恒温鼓风干燥箱OHG-907385-OHG-907385-上海新苗医疗器械制造有限公司上海新苗医疗器械制造有限公司酸度计酸度计DELTA-320DELTA-320梅特勒托利多仪器梅特勒托利多仪器(上海上海)有限公司有限公司层析拄层析拄1.0301.030上海沪西分析仪器厂上海沪西分析仪器厂恒温磁力搅拌器恒温磁力搅拌器90-290-2上海亚荣生化仪器厂上海亚荣生化仪器厂6AA猪血清IgG的提取BB 猪血清IgG的纯化C C提取液蛋白含量测定（二）试验方法（二）试验方法DD猪血清IgG分子量测定71、猪血清IgG的提取正辛酸法l准确量取猪血清准确量取猪血清40mL40mL于于500mL500mL烧杯中，加入烧杯中，加入60mmol/L 60mmol/L pH4.0pH4.0醋酸缓冲液醋酸缓冲液160mL160mL，用氢氧化钠溶液调，用氢氧化钠溶液调pH4.5pH4.5。l以每毫升稀释液加入以每毫升稀释液加入25L25L正辛酸的比例，在磁力搅拌正辛酸的比例，在磁力搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌条件下缓慢加入正辛酸，室温搅拌30min30min，44，50005000 r/min r/min离心离心30min30min，弃去沉淀。，弃去沉淀。l上清液上清液44预冷，以预冷，以1mL1mL上清液加上清液加0.227g0.227g硫酸铵的比例，硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温下继续搅拌缓慢加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，室温下继续搅拌30min30min，5000r/min5000r/min离心离心15min15min。l将沉淀溶于将沉淀溶于20mL20mL生理盐水中，透析过夜，离心去沉淀，生理盐水中，透析过夜，离心去沉淀，上清液即为上清液即为粗提粗提IgGIgG。82 2、猪血清、猪血清IgGIgG的纯化的纯化 将上述将上述IgGIgG粗品溶于少量生粗品溶于少量生理盐水后装入透析袋，悬于装有理盐水后装入透析袋，悬于装有0.01mol/L0.01mol/L，pH7.4pH7.4的的PBSPBS的大烧的大烧杯中，于磁力搅拌器上杯中，于磁力搅拌器上44透析透析24h24h，每，每6h6h换一次液。换一次液。（1 1）透析脱盐）透析脱盐9l取取2g2g预处理的预处理的DEAE-52DEAE-52纤维素纤维素、装成、装成1.530cm1.530cm，柱床高，柱床高25cm25cm层析柱。层析柱。l缓冲液缓冲液A(25mmol/L Tris-HClA(25mmol/L Tris-HCl，pH8.8pH8.8，35mmol/L NaCl)35mmol/L NaCl)平平衡。衡。l取取2mL2mL上述透析去盐母液进层析柱，上样后先用缓冲液上述透析去盐母液进层析柱，上样后先用缓冲液A A平平衡，至流出液在衡，至流出液在280nm280nm波长洗脱曲线变得平直止。波长洗脱曲线变得平直止。l以等量缓冲液以等量缓冲液A A和缓冲液和缓冲液C(25mmol/L Tris-HClC(25mmol/L Tris-HCl，pH8.8pH8.8，500mmol/L NaCl)500mmol/L NaCl)连续连续梯度洗脱梯度洗脱；控制流速；控制流速1mL/min1mL/min。l上样上样15min15min后分步收集并记录波峰，后分步收集并记录波峰，2mL/2mL/管，合并同一波管，合并同一波峰收集管。再用峰收集管。再用PBSPBS溶液透析，并进行分析鉴定。溶液透析，并进行分析鉴定。（2）DEAE-52纤维素离子交换层析纯化纤维素离子交换层析纯化IgG 103 3、提取液蛋白含量测定、提取液蛋白含量测定Folin-Folin-酚法酚法 配制标准牛血清白蛋白进行配制标准牛血清白蛋白进行Folin-酚法实验，用分酚法实验，用分光光度计测定梯度浓度标准蛋白的光光度计测定梯度浓度标准蛋白的OD280。以蛋白质的浓度为横坐标，以蛋白质的浓度为横坐标，OD280OD280值为纵坐标，绘值为纵坐标，绘制标准曲线。制标准曲线。各粗各粗IgGIgG样品液定容至样品液定容至100mL100mL，按，按Folin-酚法酚法操作，操作，通过标准曲线计算样品的蛋白质浓度。通过标准曲线计算样品的蛋白质浓度。114 4、猪血清、猪血清IgGIgG分子量测定分子量测定SDS-PAGESDS-PAGEl配制配制SDS-PAGESDS-PAGE凝胶。凝胶。l将透析过的将透析过的IgGIgG样品液和标准蛋白液与上样缓冲液混样品液和标准蛋白液与上样缓冲液混合后在沸水浴中加热合后在沸水浴中加热5min5min，各取，各取20L20L加入凝胶板的加入凝胶板的样品槽中，进行电泳。样品槽中，进行电泳。l取出凝胶平板，将凝胶浸泡在染色液中，取出凝胶平板，将凝胶浸泡在染色液中，20min20min后用后用脱色液脱色。脱色液脱色。l脱色后的凝胶在凝胶成像仪上拍照，分析，根据标脱色后的凝胶在凝胶成像仪上拍照，分析，根据标样做出标准曲线计算样品样做出标准曲线计算样品IgGIgG分子量。分子量。12电泳设备电泳设备13二、结果与讨论二、结果与讨论（一）正辛酸提取猪血清（一）正辛酸提取猪血清IgGIgG试验结果试验结果 血清提取出的球蛋白粗品为浅黄色胶状物质。血清提取出的球蛋白粗品为浅黄色胶状物质。（二）猪血清（二）猪血清IgGIgG纯化结果纯化结果 透析后的蛋白质颜色明显变浅，呈透明状。透析后的蛋白质颜色明显变浅，呈透明状。1、IgG的透析结果的透析结果14保留时间保留时间0-1.6h0-1.6h为缓冲液为缓冲液A A洗脱第一峰；洗脱第一峰；1.6h1.6h开启缓冲液开启缓冲液A-CA-C线性梯线性梯度洗脱，获得第二峰；度洗脱，获得第二峰；图示两色谱峰分离效果较好，图示两色谱峰分离效果较好，分辨率高，无重叠。分辨率高，无重叠。2 2、DEAE-52DEAE-52纤维素层析纯化纤维素层析纯化IgGIgG结果结果 用用DEAE纤维素离子交换柱进行纯化，以纤维素离子交换柱进行纯化，以OD280nm为纵坐标，洗脱时间为横坐标，绘制洗脱色谱图：为纵坐标，洗脱时间为横坐标，绘制洗脱色谱图：15图图 福林酚试剂法测蛋白质浓度标准曲线福林酚试剂法测蛋白质浓度标准曲线（三）提取液蛋白含量测定结果（三）提取液蛋白含量测定结果1 1、标准曲线、标准曲线16 分别将低盐峰和高盐峰样品吸光度代入分别将低盐峰和高盐峰样品吸光度代入蛋白质标准曲线，计算求得低盐峰样品蛋白蛋白质标准曲线，计算求得低盐峰样品蛋白质含量质含量1.45mg/mL1.45mg/mL，高盐峰样品蛋白质含量，高盐峰样品蛋白质含量为为.74mg/mLmg/mL。2 2、样品、样品IgGIgG含量测定含量测定17（四）（四）SDS-PAGESDS-PAGE测测IgGIgG分子量结果分子量结果 猪血清、纯化的猪血清、纯化的IgGIgG样品经样品经SDS-PAGESDS-PAGE电泳结果如下：电泳结果如下：1标准蛋白标准蛋白 2 猪血清猪血清 3 纯化的纯化的IgG样品样品18lIgG样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打开样品经预处理过程中巯基乙醇的作用而打开二硫键，还原成两条单链，再进一步与二硫键，还原成两条单链，再进一步与SDS结合结合成带大量负电荷的成带大量负电荷的SDS-蛋白复合物，蛋白复合物，SDS-PAGE电泳呈现两条较浓的条带。电泳呈现两条较浓的条带。l 猪血清球蛋白经正辛酸法提取，猪血清球蛋白经正辛酸法提取，DEAE纯化后，纯化后，所得所得IgG较纯净，基本无其它杂蛋白，表明该提较纯净，基本无其它杂蛋白，表明该提取纯化工艺能得到较纯净的免疫球蛋白。取纯化工艺能得到较纯净的免疫球蛋白。191 1、标准曲线制作、标准曲线制作以标准蛋白质相对分子质量的对数（以标准蛋白质相对分子质量的对数（lgMwlgMw）为纵坐标，蛋白质迁移距离为横坐标，得到以下为纵坐标，蛋白质迁移距离为横坐标，得到以下标准曲线。标准曲线。202 2、IgGIgG样品分子量测定结果样品分子量测定结果 根据样品根据样品IgG的迁移距离从标准曲线上查的迁移距离从标准曲线上查出其相对分子质量如下：出其相对分子质量如下：重链约重链约55000，轻链，轻链约约24000。即猪血清。即猪血清IgG球蛋分子量为球蛋分子量为16万左右，万左右，与文献与文献蛋白质技术手册蛋白质技术手册报道结果一致。报道结果一致。21四、总结与感想四、总结与感想 总的来说，本次试验还是成功的，虽然说总的来说，本次试验还是成功的，虽然说试验方法在细节上还有很多需要改进的地方，试验方法在细节上还有很多需要改进的地方，但实验目的已经达到。但实验目的已经达到。本次实验课是一次不同于以往的自主性实本次实验课是一次不同于以往的自主性实验课程，需要我们自己查找资料、设计实验方验课程，需要我们自己查找资料、设计实验方案，更需要我们独立思考、通过团队合作完成案，更需要我们独立思考、通过团队合作完成实验。实验。22这种以学生为主，老师为辅的实验课程让我这种以学生为主，老师为辅的实验课程让我们想得更多，学得更多，得到的也更多。在我们们想得更多，学得更多，得到的也更多。在我们开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展提供了有力的基础。提供了有力的基础。23