目的基因导入受体细胞及重组子的筛选.pptx
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1、第一节第一节 受体细胞受体细胞受受体体细细胞胞(receptor receptor cellcell):又又称称宿宿主主细细胞胞或或寄寄主主细细胞胞(host host cellcell),从从实实验验技技术术上上讲讲是是能能摄摄取取外外源源DNADNA并并使使其其稳稳定定维维持持的的细细胞胞;从从实实验验目目的的上上讲讲是是有有应应用用价价值值和和理理论论研研究究价价值值的的细胞。细胞。随随着着基基因因工工程程的的发发展展,从从低低等等的的原原核核细细胞胞,到到简简单单的的真真核核细细胞胞,进进一一步步到到结结构构复复杂杂的的高高等等动动、植植物物细细胞胞都都可可以以作作为为基基因因工工程的
2、受体细胞。程的受体细胞。1.1.受体细胞的概念受体细胞的概念2.2.受体细胞选择所应遵循的原则受体细胞选择所应遵循的原则便于重组便于重组DNADNA分子导入。分子导入。能能使使重重组组DNADNA分分子子稳稳定定存存在在于于细细胞胞中中。(如如:限限制制性性内内切切酶酶缺缺陷型,避免其对重组陷型,避免其对重组DNADNA分子的降解破坏作用。)分子的降解破坏作用。)便便于于重重组组体体的的筛筛选选。(选选择择与与载载体体所所含含的的选选择择标标记记相相匹匹配配的的受体细胞基因型)受体细胞基因型)遗传稳定性高,易于扩大培养或发酵生长。遗传稳定性高,易于扩大培养或发酵生长。安全性高,无致病性,不会对
3、外界环境造成生物污染。安全性高,无致病性,不会对外界环境造成生物污染。选选用用内内源源蛋蛋白白水水解解酶酶基基因因缺缺失失或或蛋蛋白白酶酶含含量量低低的的细细胞胞,利利于于外外源源基基因因蛋蛋白白表表达达产产物物在在胞胞内内的的积积累累,或或促促进进外外源源基基因因的的高高效效分泌表达。分泌表达。受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。具有较好的转译后加工机制,便于真核目的基因的高效表达。具有较好的转译后加工机制,便于真核目的基因的高效表达。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。3.3.各种类型受体细胞的优缺
4、点各种类型受体细胞的优缺点(1 1)原核细胞)原核细胞优点优点大大部部分分原原核核细细胞胞没没有有纤纤维维素素组组成成的的坚坚硬硬细细胞胞壁壁,便便于于外外源源DNADNA的进入。的进入。没没有有核核膜膜,染染色色体体DNADNA没没有有固固定定结结合合的的蛋蛋白白质质,这这为为外外源源DNADNA与裸露的染色体与裸露的染色体DNADNA重组减少了麻烦。重组减少了麻烦。基基因因组组简简单单,不不含含线线粒粒体体和和叶叶绿绿体体基基因因组组,便便于于对对引引入入的的外外源基因进行遗传分析。源基因进行遗传分析。原原核核生生物物多多数数为为单单细细胞胞生生物物,容容易易获获得得一一致致性性的的的的实
5、实验验材材料料,并且培养简单,繁殖迅速,实验周期短,重复实验快。并且培养简单,繁殖迅速,实验周期短,重复实验快。缺点缺点 由由于于原原核核细细胞胞缺缺乏乏真真核核生生物物具具有有的的RNARNA转转录录后后加加工工、修修饰饰系系统统、蛋蛋白白质质翻翻译译后后加加工工、修修饰饰、折折叠叠复复性性系系统统,使使某某些些真真核核细细胞胞中中编编码码蛋蛋白白的的基基因因不不能能够够在在原原核核细细胞胞中中表表达达,甚甚至至即即使使获获得得了表达,也不具有正常的生物学活性。了表达,也不具有正常的生物学活性。常用作受体细胞的原核生物:大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。常用作受体细胞的原核生物:大肠杆菌、枯草杆菌
6、、蓝藻等。大肠杆菌:大肠杆菌:基因背景清楚,繁殖迅速,培养简单。基因背景清楚,繁殖迅速,培养简单。细细胞胞膜膜间间隙隙中中含含有有大大量量的的内内毒毒素素,可可导导致致人人体体热热原原 反反映映。目目前前已已实实现现商商品品化化的的基基因因工工程程产产品品中中,大大部部分分是是由由大大肠肠杆菌工程菌生产的。杆菌工程菌生产的。枯草杆菌:枯草杆菌:基因背景清楚,繁殖迅速,培养简单。能将基因基因背景清楚,繁殖迅速,培养简单。能将基因表表达达产产物物分分泌泌到到培培养养基基中中,不不产产生生内内毒毒素素,具具有有芽芽孢孢行行成成能能力力,易于保存和培养。易于保存和培养。蓝蓝藻藻:是是一一种种自自养养生
7、生物物,培培养养简简便便易易行行;可可成成为为植植物物基基因因表表达达的宿主。的宿主。(2 2)真菌细胞)真菌细胞 真真菌菌是是低低等等的的真真核核生生物物,基基因因结结构构简简单单,基基因因表表达达调调控控机机制制以以及及蛋蛋白白质质的的加加工工与与分分泌泌都都有有真真核核生生物物的的特特征征,因因此此可可用用于于表表达真核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。达真核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。(3 3)植物细胞)植物细胞优优点点:植植物物细细胞胞具具有有全全能能性性,一一个个细细胞胞就就能能分分化化成成一一株株完完整整的的植植株株,这这就就意意味味着着一一个个获获得得外外源源基基因因
8、的的植植物物细细胞胞就就能能培培养养成成稳稳定遗传的转基因植物。定遗传的转基因植物。缺点:缺点:具有坚硬的细胞壁,外源基因无法直接导入。具有坚硬的细胞壁,外源基因无法直接导入。方法方法:(a a)经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。)经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。(b b)不必去掉细胞壁,采用农杆菌介导或基因枪等。)不必去掉细胞壁,采用农杆菌介导或基因枪等。(4 4)动物细胞)动物细胞优点:优点:动动物物细细胞胞具具有有RNARNA的的转转录录后后的的剪剪接接、加加工工机机制制,蛋蛋白白质质翻翻译译后后的加工、修饰机制,蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。的加工、修饰机制,蛋白产物
9、的生物学活性及免疫原性好。易被重组质粒易被重组质粒DNADNA转染,具有遗传稳定性和可重复性。转染,具有遗传稳定性和可重复性。可将表达产物分泌到培养基中,便于分离、纯化。可将表达产物分泌到培养基中,便于分离、纯化。缺点:缺点:不不能能通通过过一一个个细细胞胞的的培培养养获获得得转转基基因因动动物物。在在获获得得转转基基因因细细胞后,需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。胞后,需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。第二节第二节 重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞1.1.重组重组DNADNA分子导入原核细胞分子导入原核细胞(1 1)重组质粒)重组质粒DNADNA分子转化大肠杆菌分
10、子转化大肠杆菌转转化化(transformation)transformation):重重组组质质粒粒DNADNA分分子子通通过过与与膜膜蛋蛋白白结结合合进进入入受受体体细细胞胞,并并在在受受体体细细胞胞内内稳稳定定维维持持和和表表达达的的过过程程称称之之为转化。为转化。转化的方法转化的方法制备感受态细胞法制备感受态细胞法感感受受态态细细胞胞:处处于于能能吸吸收收周周围围环环境境中中DNADNA分分子子的的生生理理状状态态的的细细胞。胞。制备感受态大肠杆菌一般利用制备感受态大肠杆菌一般利用CaClCaCl2 2处理。处理。电穿孔转化法电穿孔转化法 其其基基本本原原理理是是利利用用电电穿穿孔孔仪
11、仪的的高高压压电电脉脉冲冲作作用用,在在大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞膜膜上上进进行行电电穿穿孔孔,形形成成可可逆逆的的瞬瞬间间的的通通道道,从从而而促促进进外外源源DNADNA的的有有效效吸吸收收。转转化化效效率率受受电电场场强强度度、脉脉冲冲时时间间和和外外源源DNADNA浓浓度的影响。度的影响。三亲本杂交接合转化大肠杆菌三亲本杂交接合转化大肠杆菌原原理理:是是基基于于可可迁迁移移质质粒粒的的迁迁移移作作用用(mobilizationmobilization)而而建建立立的的一一种种DNADNA转转化化方方式式。首首先先将将具具有有接接合合转转化化功功能能的的辅辅助助质质粒粒转转移移至至含含有有
12、重重组组质质粒粒的的供供体体细细胞胞中中,然然后后将将这这种种供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞进进行行混混合合,促促使使两两者者发发生生接接合合转转化化作作用用,将将重重组组质质粒粒导导入入受受体体细细胞胞。整整个个接接合合转转化化过过程程涉涉及及到到3 3种种有有关关的的细细菌菌菌菌株株,即即待待转转化化的的受受体体菌菌、含含有有要要转转化化的的重重组组质质粒粒DNADNA的的供供体体菌菌和和含含有有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌,故称三亲本杂交接合转化法。广泛宿主的辅助质粒的辅助菌,故称三亲本杂交接合转化法。转化率的计算及其影响因素转化率的计算及其影响因素转化率:转化率:DNADNA分子转
13、化受体菌获得转化子的效率。分子转化受体菌获得转化子的效率。转转化化率率 =转转化化子子数数 /DNADNA分分子子数数 (1010-5-5表表示示10105 5个个DNADNA分分子子获获 得一个转化子)得一个转化子)或或 转转化化子子数数 /DNADNA质质量量(10106 6/g g表表示示1 1 g g DNADNA分分子子得得10106 6个个转转化子)化子)辅助菌(含有结合型辅助质粒)供体菌(含有目的质粒)受体菌含有目的基因的非结合型重组质粒迁移辅助质粒转移影响转化率的因素影响转化率的因素a a:重重组组DNADNA分分子子的的大大小小、构构型型、浓浓度度、纯纯度度及及载载体体与与受
14、受体体细细胞胞的亲和性。的亲和性。b b:菌株类型:菌株类型c c:转转化化方方法法:电电穿穿孔孔法法最最高高,CaClCaCl2 2诱诱导导法法居居中中,三三亲亲本本杂杂交交接合法最低。接合法最低。(2 2)重组)重组嗜菌体嗜菌体DNADNA分子转导大肠杆菌分子转导大肠杆菌转染(转染(transfectiontransfection)及转导()及转导(transductiontransduction)转转染染:将将重重组组噬噬菌菌体体DNADNA分分子子直直接接导导入入受受体体细细胞胞中中的的过过程程称称为转染。为转染。转转导导:通通过过噬噬菌菌体体颗颗粒粒感感染染宿宿主主细细胞胞的的途途径
15、径把把外外源源DNADNA分分子子转移到受体细胞内的过程。转移到受体细胞内的过程。采采用用噬噬菌菌体体DNADNA直直接接转转染染大大肠肠杆杆菌菌的的效效率率很很低低,所所以以需需对对重重组组的的噬噬菌菌体体DNADNA进进行行体体外外包包装装后后,再再通通过过转转导导的的方方法法感感染染大肠杆菌。大肠杆菌。体外包装体外包装体体外外包包装装:在在体体外外模模拟拟噬噬菌菌体体DNADNA分分子子在在受受体体细细胞胞内内发发生生的的一一系系列列特特殊殊的的包包装装反反应应过过程程,将将重重组组噬噬菌菌体体DNADNA分分子子包包装装成成成熟的具有感染能力的成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。噬菌
16、体颗粒的技术。原原理理:根根据据噬噬菌菌体体DNADNA分分子子体体内内包包装装的的途途径径,分分别别获获得得缺缺失失D D包包装装蛋蛋白白的的噬噬菌菌体体突突变变株株和和缺缺失失E E包包装装蛋蛋白白的的噬噬菌菌体体突突变变株株。由由于于两两种种突突变变株株均均不不具具有有完完整整的的包包装装蛋蛋白白,都都不不能能单单独独的的包包装装噬噬菌菌体体DNADNA。但但将将两两种种突突变变株株分分别别感感染染大大肠肠杆杆菌菌后后,从从中中提提取取缺缺失失D D蛋蛋白白的的包包装装物物(含含E E蛋蛋白白)和和缺缺失失E E蛋蛋白白的的包包装装物物(含(含D D蛋白),两者混合后就能包装蛋白),两者
17、混合后就能包装噬菌体噬菌体DNADNA。2.2.重组重组DNADNA分子转入真核细胞分子转入真核细胞 由由于于真真核核生生物物的的细细胞胞结结构构、基基因因组组成成和和基基因因表表达达较较为为复复杂杂,适适用用于于原原核核生生物物的的转转基基因因方方法法大大多多难难以以有有效效的的用用于于真真核核生生物物。但但近近年年来来经经过过摸摸索索,建建立立了了一一系系列列适适用用于于真真核核生生物物的的转转基基因因方方法,并用这些方法有效的获得了转基因真核生物。法,并用这些方法有效的获得了转基因真核生物。(1 1)重组)重组DNADNA分子导入植物细胞分子导入植物细胞农杆菌介导的农杆菌介导的TiTi质
18、粒载体转化法质粒载体转化法 农农杆杆菌菌能能侵侵入入植植物物伤伤口口处处细细胞胞中中,其其所所具具有有的的内内源源质质粒粒-Ti-Ti质质粒粒的的T-DNAT-DNA能能转转移移至至细细胞胞内内部部。因因此此,将将外外源源基基因因与与TiTi质质粒粒重组构建载体,通过农杆菌介导可将外源基因导入植物细胞中。重组构建载体,通过农杆菌介导可将外源基因导入植物细胞中。Fig.4-16 T-DNA can integrated into the genome of plant cell多聚物介导法多聚物介导法 一一些些多多聚聚物物(聚聚乙乙二二醇醇、多多聚聚赖赖氨氨酸酸、多多聚聚鸟鸟氨氨酸酸等等)和和二
19、二价价阳阳离离子子(CaCa2+2+、MgMg2+2+、MnMn2+2+等等)于于DNADNA混混合合,能能在在原原生生质质体体表表面面形形成成沉沉淀淀颗颗粒粒,通通过过原原生生质质体体的的内内吞吞噬噬作作用用而而被被吸吸收收进进入入细胞内。细胞内。电穿孔法电穿孔法 同原核细胞的电穿孔法。同原核细胞的电穿孔法。激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法 利利用用直直径径很很小小,能能量量很很高高的的激激光光微微束束在在细细胞胞膜膜上上造造成成可可逆逆性性微孔,处于细胞周围的微孔,处于细胞周围的DNADNA分子随之进入细胞。分子随之进入细胞。超声波介导转化超声波介导转化 超超声声波波处处理理原原生生质
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- 目的 基因 导入 受体 细胞 重组 筛选
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