目的基因的制备.pptx
《目的基因的制备.pptx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《目的基因的制备.pptx(93页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、目的基因:目的基因:决定生物的优良性状、具有应用价 值或应用前景,并被用于构建物种新特性的基因。结构基因:结构基因:包括从5端mRNA转录位点开始到3端mRNA转录终止信号结束的全部功能单位。这些功能单位包括:转录启动区、核糖体识别和结合区、编码区(起始密码,开读框、终止密码)、转录终止区。1)原核生物的基因组成操纵子(操纵子(OperonOperon):):功能密切相关的基因聚 集在一起,处于同一个转录启动区的调控 之下,并具有相同的转录终止区.启动区启动区:RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。SDSD序列序列:核糖体识别和结合的序列,通常位于起译密码子上游4-9bp处。序列特
2、征为:AGGAGG,它与核糖体核糖体16S rRNA的3序列3 UCCUCC 5互补配对,从而使核糖体与mRNA结合,启动翻译过程。编码区:编码区:翻译起始密码(ATG):位于SD序列后4-9bp 多肽链编码区:翻译终止密码(TAG,TGA,TAA):某些基因后面只有一个终止密码,某些基因后面有两个终止密码.转录终止区转录终止区终止子:原核生物基因在转录终止前的一段提供 转录终止信号的DNA序列(Terminator).特点:回文结构,转录后可形成发夹状的结 构,从而使聚合酶减慢或停止前进.a)不依赖于终止因子的终止子(简单终止子)含有寡聚T序列和一段富含GC的序列 b)依赖于终止因子()的终
3、止子.不含寡聚T序列,回文结构不含富GC的序列终止因子:帮助RNA聚合酶识别终止信号的 辅助因子(Termination factor)终止子发夹结构2)真核生物基因组成 真核生物基因组的一般特点真核生物基因组的一般特点 a)基因位于染色体上,基因之间存在较长 的非编码区 b)一个结构基因内有一个或多个非编码的 间隔序列转录启动区:转录启动区:真核生物的三类RNA(rRNA,mRNA,tRNA)分别由RNA聚合酶I、II和III进行转录.它们启动子的结构也不相同.编码蛋白质的启动子由RNA聚合酶II识别.基因区:基因区:特点:a)无类似于原核基因中的核糖体识别区 b)含有不编码的间隔序列转录终
4、止区:转录终止区:含有高度保守序列AATAAA,该序列与mRNA转录后3端加poly(dA)尾有关3)其它基因组的特点病毒(噬菌体)基因组的特点 a)编码的基因位于DNA或RNA上 b)以多顺反子进行转录(SV40)c)部分基因重叠并含有内含子线粒体基因组的特点线粒体基因组的特点 a)DNA编码的蛋白与能量代谢有关 b)以多顺反子进行转录 c)无S.D序列 d)动物线粒体基因无内含子,某些植物线粒 体基因有内含子叶绿体基因组的特点叶绿体基因组的特点 a)DNA编码与光合作用有关的蛋白或酶 b)以多顺反子进行转录 c)含有类似于原核基因组的启动子和S.D序列2.基因的特殊排列对于大多数基因来说,
5、基因组中的基因一个接一个排列在DNA分子上,在基因之间存在长度不等的间隔区,但某些生物基因组中的基因存在重叠,重复,加倍和重排等现象1)基因重叠一个基因内包含另一个基因的现象 a)部分重叠:两个基因的序列部分重叠 b)完全重叠:一个基因完全包含在另一个基因内2)重复基因在某些生物基因组中,某些基因存在多个拷贝的现象*真核生物基因组中组蛋白基因3)加倍基因同一细胞中至少含有两套完全或基本相同的基因*高等生物含有两倍以上的染色体*细菌质粒DNA*蓝藻染色体4)基因重排在生物的发育过程中,同一基因簇中的基因在不同的细胞中的排列顺序发生改变的现象.它与细胞功能的分化及表达有关.*蓝藻细胞中的营养细胞和
6、异形胞中的nif基因存在重排现象第二节 目的基因的制备1.目的基因的直接分离 1)限制性核酸内切酶酶切分离:对于已知序列的DNA分子,根据DNA分子上的酶切位点进行切割,然后分离所需片断。2)物理化学分离法:根据不同DNA或RNA分子特性的差异,采用密度梯度离心、分子杂交等方法将目的基因分离出来。3)免疫法分离编码特异性蛋白基因:核糖体沿mRNA进行转译时产生多肽链,通过特异性抗体与核糖体mRNA多肽链复合体结合,然后分离纯化抗体核糖体mRNA多肽链复合体,获得特定基因的mRNA。4)酶促反转录分离特定基因:在反转录酶的作用下,合成双链DNA,获得一定大小的基因片断。2.原核生物基因组文库的构
7、建基因组文库基因组文库(Genomic library):某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体储存于某一受体菌的群体中,这个群体就称为该生物基因组的文库。目的:a)分离有用的目的基因 b)保存某种生物的全部基因1)原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA pUC载体系统:制备的基因组片段 100 kb *采用常规的基因组DNA的制备方法 载体系统:制备的基因组片段200 k bp *采用常规的基因组DNA的制备方法 要求:制备的DNA的长度为100-200kb,防止在制备过程中的机械断裂2)基因组DNA的不完全酶切 根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a)四个识别位点限制酶出现
8、的几率:1/256 b)六个识别位点限制酶出现的几率:1/1024 分离目的酶切片段大小的确定 a)克隆单个基因:10 kb b)克隆基因族:99%.文库理论克隆子数基因组总长片段平均长度 文库实际克隆子数()()片段平均长度 基因组的总长基因组大小酶切片段大小文库克隆子数的关系基因组大小酶切片段大小文库克隆子数的关系3)酶切片段与克隆载体连接酶切片段的分离与纯化a)低熔点琼脂糖回收目的片段b)试剂盒回收目的片段酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择 a)质粒载体可承载10 kb片段 b)载体可承载20 kb DNA片段 c)Cosmid 载体可承载10M bp *染色体分带技术将各个染色体分离
9、 载体系统:制备的基因组片段200 k bp *采用常规的基因组DNA的制备方法2)真核基因组DNA一级文库的构建(YAC文库)a)染色体DNA的部分酶切 获得平均长度为200-500 kb的DNA片段 *多切点限制性内切酶:EcoR I,BamH I 特点:有较多重叠克隆子 *稀切点限制性内切酶:Not I,Mlu I 特点:重叠克隆子较少 b)酶切片段与YAC克隆载体连接YAC克隆载体 pYAC4C)C)酶切片段与载体连接酶切片段与载体连接*d)重组YAC载体转化酵母球形体 1 g基因组DNA 500个转化体 e)YACe)YAC文库的筛选文库的筛选 1)探针杂交法:以特异性的探针分子与
10、文库的克隆子进行杂交 2)PCR筛选法:f)YAC基因组文库的保存活化菌体:将含重组载体的阳性克隆(AB1380 菌株)划线接种于AHC平板上,于30 oC培 养至长出1-3mm的红色菌落。短期保存:parafilm膜将平板周围封起来于4 oC 保存4-6周。长期保存:接种一个单独的YAC克隆子于3 ml YPD培养基中,在30 oC摇床振荡过夜,然 后加入1ml 80%的甘油,混匀后分装于-80 oC保存。3)真核基因组亚文库的构建(DNA载体的文库)转导转导E.coliE.coli4.cDNA4.cDNA文库的构建文库的构建cDNAcDNA文库文库:某种生物基因组转录的全部mRNA 经反转
11、录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组,储存于某种受体菌中,该群体就称该生物基因组的cDNA文库(cDNA Library).原理原理:将带poly(A)的mRNA经酶促反应转变为双链DNA,再与原核载体连接.1)制备用于克隆cDNA的mRNAa)mRNA的制备 动物细胞mRNA的制备 植物细胞mRNA的制备b)mRNA的来源 选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等 方法提高mRNA的含量c)mRNA完整性的检测 *mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量 蛋白质的能力(见下页图)哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译SDS-PAGE analysis of proteins transla
12、ted by cell-free translation system.Lane 1:protein marker;Lane 2,without mRNA;Lane 3 to 7:translation products of total mRNA from mammalian cells*mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力。*mRNA分子的大小。哺乳动物mRNA长度为500-8000 bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间。*总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力。利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNALane 1:-HindIII-EcoRI;La
13、ne 2:the first chain of cDNA;Lane 3:the second chain of cDNA;Lane 4:-HindIIId)mRNA在细胞中的丰度*高丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA 量的50-90%,该类mRNA在合成和克隆cDNA之 前不需进一步纯化特定mRNA.*低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA 量的0.5%以下.2)mRNA的富集典型的哺乳动物细胞含有10 000-30 000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝 mRNA的丰度与文库克隆子数的关系 N=ln(1-
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 目的 基因 制备
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【精****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【精****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。