目的基因的克隆与基因文库的构建.pptx
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1、5 5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建 基因工程或基因工程或DNADNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因,目的基因获得之后,或确定其表达调控机制和中分离克隆目的基因,目的基因获得之后,或确定其表达调控机制和生物学功能,或建立高效表达系统,构建具有经济价值的基因工程菌生物学功能,或建立高效表达系统,构建具有经济价值的基因工程菌(细胞),或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰,然后输回(细胞),或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰,然后输回细胞内改良生物体的遗传性状,包括人体基因治疗。细胞内改
2、良生物体的遗传性状,包括人体基因治疗。一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类:一类是构建感兴趣一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类:一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆;另立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆;另一类是利用一类是利用PCRPCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然后将之克隆表达。后将之克隆表达。A A 鸟枪法鸟枪法5 5 目的基因的克隆与基因文库的
3、构建目的基因的克隆与基因文库的构建鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNADNA片段,然后通过快速有效的筛选程序从片段,然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的众多克隆中分离出含有目的基因的目的目的重组子重组子,进而获得目的基因。鸟枪法适,进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离用于原核细菌目的基因的克隆分离 鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆
4、目的基因的基本战略染色体染色体DNADNA的切断的切断 超声波处理:超声波处理:片段长度均一,大小可控,平头末端片段长度均一,大小可控,平头末端 全酶切:全酶切:片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控大小不可控 部分酶切:部分酶切:片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整 与载体连接与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体;如果转化子采用基因产物功能检测法
5、筛选,则选择表达型载体体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为为转化受体细胞转化受体细胞 受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立)菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立)鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进
6、使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知。使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体DNADNA,然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高重组子中重组子中目的重组子目的重组子的出现频率的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNADNA 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进例如,已知某目的基因位于例如,已知某目的基因位于1.8 1.8 kbkb的的SalISalI片段中,将染色
7、体片段中,将染色体DNADNA用用SalISalI切开,琼切开,琼脂糖凝胶电泳分离,用刀片切下相当于脂糖凝胶电泳分离,用刀片切下相当于1.6-2.01.6-2.0 kbkb大小区域内的凝胶块,从此大小区域内的凝胶块,从此凝胶块中回收凝胶块中回收DNADNA片段,然后与载体进片段,然后与载体进行拼接行拼接在连接前将在连接前将DNADNA片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进冻融法冻融法滤纸法滤纸法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法溶解法溶解法凝胶凝胶DNADNA片段回收技术片段回收技术 鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因
8、的局限性工作量较大,需要了解目的基因的背景知识工作量较大,需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构B cDNAB cDNA法法5 5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建cDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序cDNAcDNA法法克隆目的基因的局限性法法克隆目的基因的局限性cDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略mDNAmDNAc cDNADNA第
9、一链的合成第一链的合成 55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 3355pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55cDNAcDNA第一链第一链引物引物退火退火逆转录酶逆转录酶dNTPsdNTPsc cDNADNA第二链的合成第二链的合成 煮沸煮沸NaOHNaOH自
10、身引导法:自身引导法:获得的双链获得的双链cDNA cDNA 55端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33Kle
11、nowKlenowdNTPsdNTPsS1S1c cDNADNA第二链的合成第二链的合成 DNApol dNTPsDNApol dNTPsRNaesHRNaesH置换合成法:置换合成法:获得的双链获得的双链cDNA cDNA 55端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAApp 5555S1S1 AAAA AAAATTTTTTOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
12、TTTTTTTpp 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3333T4-DNA ligaseT4-DNA ligasec cDNADNA第二链的合成第二链的合成 dCTPdCTPTdTTdT引导合成法:引导合成法:获得的双链获得的双链cDNA cDNA 能保留完整的能保留完整的55端序列端序列55pppppp55G G AAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTpp 5533 HOHO55pppppp55G G AAAA
13、AAAAAACCCCCCCCCCCCCCOHOH 3333 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGG33 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGGAAAAAAAAAAOHOH 33NaOHNaOH退火退火KlenowKlenowdNTPsdNTPscDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略双链双链c cD
14、NADNA的克隆的克隆 双链平头的双链平头的cDNAcDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中:通常可以使用下列三种方法克隆入载体中:平头末端直接与载体连接,平头末端直接与载体连接,但插入的片段无法回收但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾,平头两端分别接同聚物尾,最好是最好是ATAT同聚物尾,这样重组同聚物尾,这样重组分子可通过加热局部变性和分子可通过加热局部变性和S1S1核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口,加装人工接头引入酶切口,以便插入片段回收以便插入片段回收 cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序完备分离程序完备分离程序
15、 提提取取细细胞胞总总mRNAmRNA,合合成成总总cDNAcDNA,将将之之全全部部克克隆隆,然然后后借助于合适的筛选手段找到借助于合适的筛选手段找到目的重组子目的重组子 筛筛选选时时,若若使使用用的的是是多多拷拷贝贝载载体体,则则采采用用菌菌落落原原位位杂杂交交法法筛选;若使用的是表达型载体,则采用菌落免疫杂交法筛选筛选;若使用的是表达型载体,则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于完备分离程序适用于mRNAmRNA分子数少的目的基因的克隆,分子数少的目的基因的克隆,如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIIIVIII基因等基因等 cDNAcDNA法
16、分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序特异分离程序特异分离程序 提提取取细细胞胞总总mRNAmRNA,琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离,回回收收目目标标mRNAmRNA,由此合成双链由此合成双链cDNAcDNA,然后进行克隆然后进行克隆 特特异异分分离离程程序序较较适适用用于于mRNAmRNA丰丰度度极极高高的的目目的的基基因因克克隆隆如血红蛋白基因等如血红蛋白基因等 cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序差异分离程序差异分离程序 利用两组细胞利用两组细胞mRNAmRNA种类的差异,分离克隆差异种类的差异,分离克隆差异mRNAmRNA所对所对应的应的cDN
17、AcDNA,因而这种程序较适用于分离克隆新基因因而这种程序较适用于分离克隆新基因 例如:正常的大鼠例如:正常的大鼠FR3T3FR3T3成纤维细胞中,有些新基因是不能成纤维细胞中,有些新基因是不能自发表达的,需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克自发表达的,需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因,进而研究其生物学功能隆这些新基因,进而研究其生物学功能 差异分离程序差异分离程序 多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的FR3T3FR3T3细胞细胞正常的正常的FR3T3FR3T3细胞细胞总总mRNAmRNA总总mRNAmRNAcDNAcDNA双链双链cDNAcDNA单链单链cDNAcDN
18、A提取提取mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA合成第二链合成第二链克隆克隆提取提取mRNAmRNA共价交联共价交联上柱上柱原位杂交原位杂交病毒诱导表达的基因病毒诱导表达的基因cDNAcDNA克隆克隆cDNAcDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的并非所有的mRNAmRNA分子都具有分子都具有polyApolyA结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNAmRNA半衰期很短半衰期很短mRNAmRNA在细胞中含量少,对酶和碱极为敏感,在细胞中含量少,对酶和碱极为敏感,分离纯化困难分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因 C PCRC PCR法法5
19、 5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建 PCRPCR(Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction)法,又称为法,又称为聚合酶聚合酶链反应链反应或或PCRPCR扩增技术扩增技术,是一种高效快速的体外,是一种高效快速的体外DNADNA聚合程序聚合程序 使用使用PCRPCR法克隆目的基因的前提条件是:已知待扩增目的法克隆目的基因的前提条件是:已知待扩增目的基因或基因或DNADNA片段两侧的序列,根据该序列化学合成聚合反应必片段两侧的序列,根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物需的双引物 PCRPCR法定向扩增目的
20、基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理5555目的基因目的基因55变性变性加热加热5555引物引物退火退火5555底物底物聚合聚合55555555加热加热变性变性55555555555555555555555555555555555555555555555555退火退火 引物引物底物底物聚合聚合加热加热变性变性引物引物退火退火底物底物聚合聚合112233 由由Taq DNATaq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCRPCR产物中,其产物中,其33末端总是会带有末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基,而且这个碱基几乎总是一个非模板依赖型的突出碱基,而且这个碱基几乎总是A A,因为因为Taq
21、 DNATaq DNA聚合酶对聚合酶对dATPdATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在,克隆时即可以采取存在,克隆时即可以采取TdTTdT末端加同聚尾的方法与载体拼接,末端加同聚尾的方法与载体拼接,也可以使用专门的也可以使用专门的T T载体载体克隆克隆 PCRPCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序5555AAAATTTT5555PCRPCR扩增产物扩增产物T T 载体载体T7T7lacZlacZMCSMCSorioriApAprrD D 化学合成法化学合成法5 5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建化学合成法的基本战
22、略化学合成法的基本战略化学合成的单元操作化学合成的单元操作DNADNA化学合成的用途化学合成的用途化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的化学合成目的基因的前提条件是基因的DNADNA序列已知,有三种战略:序列已知,有三种战略:小片段粘接法:小片段粘接法:混合退火混合退火根据目的基因全序列,分别合成根据目的基因全序列,分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段小片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成补钉延长法:
23、补钉延长法:混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因两条互补链两条互补链全序列,分别合成全序列,分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段以及小片段以及20-3020-30碱基长的单链碱基长的单链DNADNA中片段中片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成大片段酶促法:大片段酶促法:混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因的的全序列,分别合成全序列,分别合成40-5040-50碱基长的单链碱基长的单链DNADNA片段片段T4-DN
24、AT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成 上述三种方法各有利弊:化学合成上述三种方法各有利弊:化学合成DNADNA的的单片段愈短,收率就单片段愈短,收率就愈高,但由于化学合成的份额较大,成本较高;在大片段酶促法合愈高,但由于化学合成的份额较大,成本较高;在大片段酶促法合成目的基因时,虽然化学合成的份额相对较小,成本较低,但大片成目的基因时,虽然化学合成的份额相对较小,成本较低,但大片段化学合成的收率极低,例如,每聚合一个单体的产物收率为段化学合成的收率极低,例如,每聚合一
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