目的基因的连接与转化.pptx
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1、目的基因的目的基因的连接、转化连接、转化分类及原理分类及原理分类分类:根据限制性内切酶酶切后产生的末端根据限制性内切酶酶切后产生的末端的类型,分为非互补突出末端的连接、相的类型,分为非互补突出末端的连接、相同粘性末端的连接、平末端连接同粘性末端的连接、平末端连接DNADNA连接示意图连接示意图载体自连及去磷酸化载体自连及去磷酸化常用碱性磷酸酶常用碱性磷酸酶BAP(大肠杆菌)CIAP(小牛肠)分子量 80,000温度 60 65最适PH8.0热稳定性好,100 暂时性失活,室温放置可恢复活性,苯酚完全失活分子量 100,000温度 37 最适PH10.0附近(高底物浓度)PH 8.0附近(低底物
2、浓度)6530分钟处理99的活性不可逆失活,随具体条件改变有变动,完全失活苯酚处理本实验连接材料及连接本实验连接材料及连接体系体系连接示意图连接示意图连接体系连接体系载体DNA 17 ng目的DNA 50 ng连接缓冲液(5)1.2 ul用蒸馏水稀释至6ul附注:附注:目的DNA的总体积是3ul,如果不够总质量以总体积为准1.1.载体和插入片段的摩尔浓度比载体:插入片段的摩尔数的变化范围可载体和插入片段的摩尔浓度比载体:插入片段的摩尔数的变化范围可为为8 8:1 1到到1 1:1616,但通常的变化范围是,但通常的变化范围是3 3:1 1到到1 1:3 3。插入片段的长度和。插入片段的长度和序
3、列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验,来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积实验,来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中,通常一个连接反应用中,通常一个连接反应用10-50ng10-50ng的载体的载体DNADNA。2.2.进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言,平末端连进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言,平末端连接在接在2222保温保温4-164-16小时,粘性末端在小时,粘性末端在2222保温保温3 3小时,或小时,或1616保温保温1616小
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