细胞电生理研究进展.pptx
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1、细胞电生理研究进展细胞电生理研究进展一 电压钳(voltage clamp)技术 20世纪世纪50年代,年代,Hodgkin and Huxley 首次应用首次应用电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流的测定。电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流的测定。l 在在在在枪乌贼枪乌贼枪乌贼枪乌贼大纤维内纵向插入大纤维内纵向插入大纤维内纵向插入大纤维内纵向插入两根细铂丝两根细铂丝两根细铂丝两根细铂丝,一,一,一,一根记录根记录根记录根记录电压电压电压电压E E E E,另一根记录,另一根记录,另一根记录,另一根记录电流电流电流电流I I I I。记录膜电位。记录膜电位。记录膜电位。记录膜电位E E E E与
2、与与与调定电压差值经放大进入快速电压调定电压差值经放大进入快速电压调定电压差值经放大进入快速电压调定电压差值经放大进入快速电压-电流转换器电流转换器电流转换器电流转换器(FBA),(FBA),(FBA),(FBA),加入加入加入加入反馈电流反馈电流反馈电流反馈电流I I I I,直至膜电位与调定电压直至膜电位与调定电压直至膜电位与调定电压直至膜电位与调定电压相等为止相等为止相等为止相等为止,维持膜电压不变。维持膜电压不变。维持膜电压不变。维持膜电压不变。l l 当一个当一个当一个当一个神经冲动神经冲动神经冲动神经冲动到达时,出现到达时,出现到达时,出现到达时,出现膜离子电流膜离子电流膜离子电流
3、膜离子电流,为了为了为了为了维持膜电位不变维持膜电位不变维持膜电位不变维持膜电位不变,就必须输入一个与膜离子,就必须输入一个与膜离子,就必须输入一个与膜离子,就必须输入一个与膜离子电流大小相等,方向相反的电流大小相等,方向相反的电流大小相等,方向相反的电流大小相等,方向相反的补偿电流补偿电流补偿电流补偿电流,记录下这个记录下这个记录下这个记录下这个补偿电流就是补偿电流就是补偿电流就是补偿电流就是膜电流的镜像膜电流的镜像膜电流的镜像膜电流的镜像。工作原理:工作原理:离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础。离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础。电生理实验以电流作为刺激源,使可兴奋
4、细胞产生兴奋,然后电生理实验以电流作为刺激源,使可兴奋细胞产生兴奋,然后测定其膜电压以确定离子通道的状态。但在形成动作电位时所测定其膜电压以确定离子通道的状态。但在形成动作电位时所产生的离子流可影响膜电位,而膜电位的变化又会影响该离子产生的离子流可影响膜电位,而膜电位的变化又会影响该离子的通透性的变化。因而,须人为地使膜电位在一定时间内维持的通透性的变化。因而,须人为地使膜电位在一定时间内维持在一个固定水平。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极在一个固定水平。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极人为向胞内补充电流,补充的电流正好等于跨膜流出的反相离人为向胞内补充电流,补充的电流正好等于跨膜
5、流出的反相离子电流(大小相等方向相反)。子电流(大小相等方向相反)。意义意义:1)确保膜通透性发生改变时,控制膜电位始终维持在)确保膜通透性发生改变时,控制膜电位始终维持在指令电位的水平(不变);指令电位的水平(不变);2)通过电流检测装置,记录到补充)通过电流检测装置,记录到补充入胞内的注入电流,它相当于离子电流的反相电流。这样可测入胞内的注入电流,它相当于离子电流的反相电流。这样可测定在不同膜电位水平的离子电流,从而了解膜通道的电导及功定在不同膜电位水平的离子电流,从而了解膜通道的电导及功能活动。能活动。(一)电压钳 基本原理离子通道电流:细胞膜上的电流 膜电容充放电电流 电压钳技术消除膜
6、电容电流的影响 电压钳技术的基本原理:用微电极将膜电压钳制到新的数值上,保持一段时间不变使膜电容完成充放电过程进入电压钳制的稳态期,测得的跨膜电流可以认为来自于离子通道电流。(二)理想的电压钳(二)理想的电压钳存在问题:没有考虑钳制电压的微电极阻抗RCE(兆欧姆数量级)若考虑微电极电阻,钳制电压VC就就被分压,并且,膜电阻Rm 可以有大幅度改变,(三)双电极电压钳(三)双电极电压钳 加记录电极实现闭环电路的反馈控制加记录电极实现闭环电路的反馈控制加记录电极实现闭环电路的反馈控制加记录电极实现闭环电路的反馈控制 A1和和A2为两个高增益的运算放大器,为两个高增益的运算放大器,A1连接成电压跟随器
7、,提供连接成电压跟随器,提供 高输入阻抗和低输出阻抗;高输入阻抗和低输出阻抗;A2连接成负反馈放大器。连接成负反馈放大器。(四)单电极电压钳(四)单电极电压钳 在电压钳制的稳态期,钳制电压在电压钳制的稳态期,钳制电压V VC C=V=Vmm(R(Rmm R RCECE)/R)/Rmm 只有当钳制电极的电阻只有当钳制电极的电阻R RCECE远小于细胞膜电阻远小于细胞膜电阻R Rmm时,时,V VmmVVC C二、膜片钳实验技术二、膜片钳实验技术 膜片钳技术是细胞生物学研究的一个重大发明。由德国神经生物学家赫尼(Neher)和萨克曼(Sakmann)在1970s年代中期发明,1991年两人共同荣获
8、诺贝尔生理学和医学奖。NeherSakmann(一)膜片钳技术发展历史 19761976年德国马普生物物理化学研究所年德国马普生物物理化学研究所NeherNeher和和SakmannSakmann首次首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时,记录到在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时,记录到AChACh激激活的单通道离子电流,从而产生了膜片钳技术。活的单通道离子电流,从而产生了膜片钳技术。19801980年年SigworthSigworth等在记录电极内施加等在记录电极内施加5-50 cmH5-50 cmH2 2O O的负压吸的负压吸引,得到引,得到10-100G10-100G的高阻封接(
9、的高阻封接(Giga-sealGiga-seal),大大降低了记),大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。流的突破。19811981年年HamillHamill和和NeherNeher等对该技术进行了改进,引进了膜等对该技术进行了改进,引进了膜片游离技术和全细胞记录技术,从而使该技术更趋完善,具片游离技术和全细胞记录技术,从而使该技术更趋完善,具有有1pA1pA的电流灵敏度、的电流灵敏度、1m1m的空间分辨率和的空间分辨率和10s10s的时间分辨率。的时间分辨率。19831983年年1010月,月,Sing
10、le-Channel RecordingSingle-Channel Recording一书问世,奠定一书问世,奠定了膜片钳技术的里程碑。了膜片钳技术的里程碑。Sakmann Sakmann 和和NeherNeher也因其杰出的工作也因其杰出的工作和突出贡献,荣获和突出贡献,荣获19911991年诺贝尔医学和生理学奖。年诺贝尔医学和生理学奖。(二)膜片钳技术的原理 同电压钳,同电压钳,同电压钳,同电压钳,用特制的玻璃微吸管吸附于用特制的玻璃微吸管吸附于用特制的玻璃微吸管吸附于用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面细胞表面细胞表面细胞表面,使之形成使之形成使之形成使之形成101010101001001
11、00100的密封的密封的密封的密封(giga-seal)(giga-seal)(giga-seal)(giga-seal),被孤立的小膜片面积为,被孤立的小膜片面积为,被孤立的小膜片面积为,被孤立的小膜片面积为mmmm量级量级量级量级,内中仅有少数离子通道。使与内中仅有少数离子通道。使与内中仅有少数离子通道。使与内中仅有少数离子通道。使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域电极尖开口处相接的细胞膜的小区域电极尖开口处相接的细胞膜的小区域电极尖开口处相接的细胞膜的小区域(膜片)与其周围在电学上绝缘,然后(膜片)与其周围在电学上绝缘,然后(膜片)与其周围在电学上绝缘,然后(膜片)与其周围在电学上绝缘,
12、然后对该膜片实行电压钳位,可测量单个离对该膜片实行电压钳位,可测量单个离对该膜片实行电压钳位,可测量单个离对该膜片实行电压钳位,可测量单个离子通道开放产生的子通道开放产生的子通道开放产生的子通道开放产生的pApApApA(10101010安培)量级的安培)量级的安培)量级的安培)量级的电流,这种通道开放是一种随机过程。电流,这种通道开放是一种随机过程。电流,这种通道开放是一种随机过程。电流,这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变通过观测单个通道开放和关闭的电流变通过观测单个通道开放和关闭的电流变通过观测单个通道开放和关闭的电流变化,可直接得到各种离子通道开放的电化,可直
13、接得到各种离子通道开放的电化,可直接得到各种离子通道开放的电化,可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放寿命分布流幅值分布、开放几率、开放寿命分布流幅值分布、开放几率、开放寿命分布流幅值分布、开放几率、开放寿命分布等功能参量,并分析它们与膜电位、离等功能参量,并分析它们与膜电位、离等功能参量,并分析它们与膜电位、离等功能参量,并分析它们与膜电位、离子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附的膜片从细胞膜上分离出来,以膜的外的膜片从细胞膜上分离出来,以膜的外的膜片从细胞膜上分离出来,以膜
14、的外的膜片从细胞膜上分离出来,以膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。这种技术对小细胞的电压钳位、研究。这种技术对小细胞的电压钳位、研究。这种技术对小细胞的电压钳位、研究。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很改变膜内外溶液成分以及施加药物都很改变膜内外溶液成分以及施加药物都很改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。方便。方便。方便。(一)膜片钳技术的原理 1 显微照片2 单个离子通道电流3 多个离子通道电流的叠加。双电极电压钳技术低电阻P2、高增益A2时,Vm
15、Vc 对细胞有损伤,不宜于小细胞 单电极电压钳技术(膜片钳)电极电阻远小于膜片电阻,A1高增益,A2单位增益(检测),运算放大器的正负输入端子为等电位,向正输入端子施加指令电位、经过短路负端子可以使膜片等电位,达到电位钳制的目的。当膜片微电极尖端与膜片之间形成10G欧(以上封接时其间的分流电流达到最小,横跨膜片的电流(I)可100做为来自膜片电极的记录电流(Ip)而被测量出来。RsealIpIIpRfR0R0是与膜片阻抗相串联的局部串联电阻(或称输入阻抗)。R0通常为1-5 M欧,如果Rseal高达 10G欧,此时Ip/I=Rseal/(R0+Rseal).此时Ip可作为在IV转换器(点线)内
16、的高阻抗反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。实际上这时场效应管运算放大器A1的输出中包括着膜电阻成分,这部分将在第二级场效应管运算放大器A2时被减掉。RsealIpIIpRfR0(二二)膜片钳电极的制备膜片钳电极的制备n n1.标本制备根据研究目的的不同,可采标本制备根据研究目的的不同,可采用不同的细胞组织,如心肌细胞、平滑肌用不同的细胞组织,如心肌细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等,现在几乎可对各种细细胞、肿瘤细胞等,现在几乎可对各种细胞进行膜片钳的研究。对所采用的细胞,胞进行膜片钳的研究。对所采用的细胞,必须满足实验要求,一般多采用酶解分离必须满足实验要求,一般多采用酶解分离法,也可采用细胞培养
17、法;另外,由于与法,也可采用细胞培养法;另外,由于与分子生物学技术的结合,现在也运用分子分子生物学技术的结合,现在也运用分子克隆技术表达不同的离子通道,如利用非克隆技术表达不同的离子通道,如利用非洲爪蟾卵母细胞表达外源性基因等。洲爪蟾卵母细胞表达外源性基因等。n n2.电极制备合格的膜片微电极是成功封电极制备合格的膜片微电极是成功封接细胞膜的基本条件。要成功的封接细胞接细胞膜的基本条件。要成功的封接细胞膜需要两方面的因素保证,一是设法造成膜需要两方面的因素保证,一是设法造成干净的细胞膜表面,二是制成合格的电极。干净的细胞膜表面,二是制成合格的电极。首先要选择适当的玻璃毛细管,其材料可首先要选择
18、适当的玻璃毛细管,其材料可使用软质玻璃(苏打玻璃、电石玻璃)或使用软质玻璃(苏打玻璃、电石玻璃)或硬质玻璃(硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻硬质玻璃(硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃)。软玻璃电极常用于作全细胞记录,璃)。软玻璃电极常用于作全细胞记录,硬质玻璃因导电率低、噪声小而常用于离硬质玻璃因导电率低、噪声小而常用于离子单通道记录。子单通道记录。电极玻璃3.电极在实验前要电极在实验前要灌注电极液,由于电极尖,由于电极尖端较细,因此在充灌前,电极内液要用端较细,因此在充灌前,电极内液要用0.2 m的滤膜进行过滤。一般电极充灌可分灌的滤膜进行过滤。一般电极充灌可分灌尖尖(tipfilling)和后充和后
19、充(backfilling)两步。灌尖两步。灌尖时将电极尖端浸入内液中时将电极尖端浸入内液中5s即可,由于毛细即可,由于毛细作用溶液会进入电极最尖端处,然后从电作用溶液会进入电极最尖端处,然后从电极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附近将溶液充至近将溶液充至1/4长度,用手指轻轻弹除尖长度,用手指轻轻弹除尖端残留的气泡即可。灌注后的电极电阻一端残留的气泡即可。灌注后的电极电阻一般为般为25M,而全细胞记录则最好在,而全细胞记录则最好在23M。4.进行实验,记录和分析数据准备工作就进行实验,记录和分析数据准备工作就绪后即可进行实验操作,数据记录和分析绪后即可进行
20、实验操作,数据记录和分析膜片钳实验技术的新发展膜片钳实验技术的新发展 传统膜片钳技术主要优缺点总结传统膜片钳技术主要优缺点总结 优优优优 点点点点缺缺缺缺 点点点点A A高信息量高信息量高信息量高信息量:能改变细胞膜电位能改变细胞膜电位能改变细胞膜电位能改变细胞膜电位,单细胞记单细胞记单细胞记单细胞记录录录录A A需要受过良好训练的电生理学需要受过良好训练的电生理学需要受过良好训练的电生理学需要受过良好训练的电生理学专家专家专家专家B B高灵敏性高灵敏性高灵敏性高灵敏性:能记录到能记录到能记录到能记录到pApA级电流变化和单级电流变化和单级电流变化和单级电流变化和单通道开关状态通道开关状态通道
21、开关状态通道开关状态B B通量很低通量很低通量很低通量很低,一天的实验数据量不一天的实验数据量不一天的实验数据量不一天的实验数据量不超过超过超过超过1010C C灵活性好灵活性好灵活性好灵活性好:可以控制改变细胞膜内外的溶可以控制改变细胞膜内外的溶可以控制改变细胞膜内外的溶可以控制改变细胞膜内外的溶液成分液成分液成分液成分C C劳动力投入密集劳动力投入密集劳动力投入密集劳动力投入密集,试验操作过程试验操作过程试验操作过程试验操作过程复杂复杂复杂复杂D D应用范围广应用范围广应用范围广应用范围广:可以分析检测所有的离子通可以分析检测所有的离子通可以分析检测所有的离子通可以分析检测所有的离子通道类
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