盛兆生物细胞健康检测.pptx
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1、内容nADME检测n细胞凋亡n细胞活力检测n细胞毒性检测n谷胱甘肽测定n线粒体功能检测ADME:毒药物动力学对外源化学物ADME过程的研究意义n可用来确定与毒性发生有关的靶器官或组织的暴露特征。n可为在其他的毒性研究的剂量选择提供有用数据。n有助于阐明两种或两种以上外源化学物联合毒作用的机制。n可通过改变外源化学物ADME过程,以预防和治疗外源化学物中毒。代谢(转化)类型代谢(转化)类型 可分两类:第一类包括氧化、还原及水解过程;第二类为结合过程,第一类转化产物再经与体内某些代谢物结合,产物一般水溶性加大,利于排泄。n(1)第一阶段反应(第一类型):氧化、还原及水解等。氧化,如醇氧化、醛氧化、
2、单胺氧化、氧化脱氢及N-氧化等;还原,如硝基还原成氨基(-NH2)。n(2)第二阶段反应(第二类型):即结合反应,使药失效,随尿排出。含羟基、羧基、胺基的化合物与葡萄糖醛酸结合成酯、醚、酰胺化合物;硫酸可与酚类药物及酚性类固醇结合成硫酸酯;N-甲转移酶使伯胺、肿胺及叔胺甲基化,以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供应体;磺胺类及芳香族氨基等在乙酰辅酶A参与下乙酰化。ADME&Metabolism产品产品P450-Glo Assays&Screening SystemsGSH-Glo Assay UGT-Glo Assays&Screening SystemsMAO-Glo Assay Pgp-Glo A
3、ssay System UGT活性检测活性检测n哺乳类动物最重要的结合反应 药物结构中的功能基团结合生成葡萄糖醛酸GA的结合物 UDPGA(尿核苷二磷酸葡萄糖醛酸):GA的活性供体Pgp-Glo Assay SystemsnPgp,也被称为MDR1 和ABCB1,是一种 170kDa 的完整的质膜蛋白,其生物学功能为依赖ATP 的药物泵,在多药抗药性和某些不良药物相互作用中发挥重要作用。nPgp-Glo 试剂盒检测化合物对膜制备物中重组人类Pgp 活性的影响。该试剂盒建立在依赖于ATP 的萤火虫萤光素酶反应上,该反应可产生光信号。ATP 先与Pgp 共同孵育,然后Pgp ATP 酶反应被终止,
4、未被消耗的 ATP 由萤光素产生的发光信号而被检测出来。Pgp依赖的发光信号的降低反映了Pgp 对ATP 的消耗,因此信号减少得越多,Pgp 的活力就越高。相应地,若待测样品中含有可刺激Pgp ATP 酶的化合物,这个反应产生的发光信号会显著低于未经处理的对照组。细胞凋亡(apoptosis/(programmed cell death,PCD)n细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取
5、的一种死亡过程。Post Caspase-3 Toolscaspase3DNA CleavageFas/TNFReceptorFADDstaurosporineantitumoragentsprotein cleavage(e.g.,PARP)Apaf-1Cyt ccaspase8caspase9Anti-PARP p85Fragment pAbDeadEnd ColorimetricDeadEnd FluorimetricCaspase AssaysCaspACE Assay System,ColorimetricCaspACE Assay System,FluorimetricApo-On
6、e Homogeneous Caspase-3/7 AssayCaspase-Glo 2 AssayCaspase-Glo 3/7 AssayCaspase-Glo 6 AssayCaspase-Glo 8 AssayCaspase-Glo 9 Assay-Glo!FluorColorCaspACE Assay SystemsAc-DEVD-AMC Ac-DEVD+AMC fluorometricAc-DEVD-pNA Ac-DEVD+pNA colorimetricCaspase 1/3Apo-One Homogeneous Caspase-3/7 AssayZ-DEVD-R110-DEVD
7、-ZZ-DEVD +Caspase 3/7R110ConsensusTetrapeptides VDVAD:Caspase-2 DEVD:Caspase-3/7VEID:Caspase-6LETD:Caspase-8LEHD:Caspase-9Using Bioluminescence to Monitor Caspase ActivityAAAAAAAA100 +100细胞活力n在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力.Cell-Titer 产品nCellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assa
8、y(MTT)nCellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay(MTS)nCellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)nCellTiter-Blue Cell Viability AssaynCellTiter-Fluor Cell Viability AssaynCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay ColorFluor-Glo!CellTiter 961-4hr37CAdd Cel
9、lTiter 96Reagent(MTS/PMS)ReadAbsorbance490nmCells are not lysed so if color development is not to your liking,put back in incubator.MTSMTSformazan(soluble)PESreducedPESNADHNAD+PES transports reducing equivalents from the interior of the cell to the exterior.Dead cells have lost reducing ability.One
10、solution/Two solution100 +20Appearance of CellTiter 96 Assay PlateDecreasing Cell NumberCellTiter-Blue Cell Viability Assay:Resazurin fluorescent assay 1-4hr37CAdd CellTiter-Blue ReagentReadFluorescence560Ex/590EmCat.#G3580,G3581,G3582Multiplexing capability,purest resazurinCells are not lysed so if
11、 color development is not to your liking,put back in incubator.May need optimization.ResazurinResorufinResazurin is reduced by metabolically active cells.Dead cells cannot reduce the compound.Reducing EnzymesYou can read the absorbance but sensitivity suffers.100 cells vs.3000 cells100 +20Appearance
12、 of CellTiter Blue Assay PlateDecreasing Cell Number(570-600nm)CellTiter-Fluor Cell Viability Assay:live-cell protease measuredcpdcp“Dead cell”Proteasereleased from cells with compromised membranes does not contribute to signalGF-AFCGF+AFClcplcp“Live Cell”Protease(lcp)within intact cells cleavescell
13、 permeable GF-AFC.LCP enzyme degradedoutside cell,does not contribute to signal.Add 100l of GF-AFC diluted in Assay BufferRead FluorescenceLive:400Ex/505Em0.5-3 hoursCat.#G6080,G6081,and G6082 Multiplex with reporter assays and other luminescent and fluorescent assays;only a 15 minute fluorescent,no
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