目的基因导入受体细胞2.pptx
《目的基因导入受体细胞2.pptx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《目的基因导入受体细胞2.pptx(134页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、第六章第六章目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞第三节 重组子的筛选 在重组在重组DNADNA分子的转化、转染或转导过程分子的转化、转染或转导过程中,一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必中,一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子出期待的克隆子。概念概念克隆子克隆子转化子转化子重组子重组子将摄取外源将摄取外源DNADNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为体细胞统称为克隆子克隆子。把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫
2、做转化转化子(子(导入外源导入外源DNADNA分子后能稳定存在的受体细胞称为分子后能稳定存在的受体细胞称为转转化子化子),现在这两者有通用的趋向。现在这两者有通用的趋向。含有含有重组重组DNADNA分子分子的克隆子被称为的克隆子被称为重组子重组子,如果重组子如果重组子中含有中含有外源目的基因外源目的基因则又称为则又称为阳性克隆子阳性克隆子或或期望重组子期望重组子。经过各种方法将外源经过各种方法将外源DNADNA分子导入受体细胞后,获得所分子导入受体细胞后,获得所需阳性克隆子的过程称为需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选克隆子的筛选。一、遗传表型直接筛选法(一)根据载体选择标记初步筛选转化子(一)
3、根据载体选择标记初步筛选转化子在构建基因工程载体系统时,通常在载体在构建基因工程载体系统时,通常在载体DNADNA分子分子中组装了一种或两种中组装了一种或两种选择标记基因选择标记基因,在受体细胞,在受体细胞内进行表达,呈现出特殊的表型或遗传学特性,内进行表达,呈现出特殊的表型或遗传学特性,作为作为筛选转化子的依据。筛选转化子的依据。一般的做法一般的做法是是:将转化处理后的受体细胞接种在含适将转化处理后的受体细胞接种在含适量量选择药物的培养基选择药物的培养基上,在最适生长温度上,在最适生长温度条件下培养一定时间,根据菌落生长情况条件下培养一定时间,根据菌落生长情况挑选出转化子。挑选出转化子。常用
4、的常用的选择标记选择标记基因基因主要是:主要是:抗性基因;抗性基因;表达产物可以表达产物可以发光或使反应底发光或使反应底物显色的基因物显色的基因相应的选择条件相应的选择条件是:是:可以可以被抗性基因产被抗性基因产物分解的抗生素物分解的抗生素;可以使基因产物发可以使基因产物发光的光线,或者是可光的光线,或者是可以使基因产物显色的以使基因产物显色的试剂。试剂。选择培养基选择培养基是:是:根据宿主细胞类型配置的培养基,对于根据宿主细胞类型配置的培养基,对于细菌受体细胞细菌受体细胞而言,通常用而言,通常用LBLB培养基,培养基,在在LBLB培养基中加入适量的某种选择物,即为培养基中加入适量的某种选择物
5、,即为选择培养基。选择培养基。选择物:选择物:是由是由载体载体DNADNA分子上携带的分子上携带的选择标记基选择标记基因因所决定。所决定。(一)根据载体选择标记初步筛选转化子(1 1)抗药性筛选)抗药性筛选(2 2)插入失活筛选法)插入失活筛选法(3 3)插入表达筛选法)插入表达筛选法(4 4)显色互补筛选法)显色互补筛选法(5 5)利用报告基因筛选植物转化细胞)利用报告基因筛选植物转化细胞(6 6)利用遗传选择标记筛选哺乳动物)利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞转基因细胞(1 1)抗药性筛选)抗药性筛选正向选择方式正向选择方式注意:注意:利用利用含一种选择药物的选择培养基含一种选择药物的
6、选择培养基无法无法区分重组子和非重组子,只能区分转化子区分重组子和非重组子,只能区分转化子和非转化子。和非转化子。非转化子呈非转化子呈 ApAps s、TcTcs s 转化子呈转化子呈 ApApr r、TcTcr r/s/s(2)插入失活筛选法双抗药性筛选双抗药性筛选双双(3)插入表达筛选法利用外源目的基因插入特定载体后能利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛激活筛选标记基因的表达,选标记基因的表达,由此进行转化子的筛由此进行转化子的筛选。选。有些载体在设计时,在筛选标记基因前面连有些载体在设计时,在筛选标记基因前面连接上一段接上一段负调控序列负调控序列,当,当插入失活该负调插入失活该负调控序
7、列控序列时,其下游的筛选标记基因才能表时,其下游的筛选标记基因才能表达。达。例如例如pTR262pTR262质粒载体,它由质粒载体,它由pBR322pBR322衍生而来,其衍生而来,其TcTcr r基因的上游基因的上游含有一段含有一段噬菌体噬菌体DNADNA的的CICI阻遏蛋白编码阻遏蛋白编码基因及其调控序列,基因及其调控序列,CICI基因表达的阻遏蛋白可以抑制基因表达的阻遏蛋白可以抑制TcTcr r基因的表达。基因的表达。当外源当外源DNADNA片段片段插入插入CICI基因的基因的Hin dHin d或或BglBgl位点位点上时,上时,CICI基因失活。基因失活。TcTcr r基因基因因阻碍
8、解除而得因阻碍解除而得以以表达表达,故阳性重组子为,故阳性重组子为TcTcr r表型。表型。质粒本身质粒本身因为因为TcTcr r基因受阻碍为基因受阻碍为TcTcs s表型表型,当转化细,当转化细菌涂布在菌涂布在TcTc平板上时,只有含有外源平板上时,只有含有外源DNADNA插入片段的阳插入片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。性重组子的转化菌才能生长成菌落。(4)显色互补筛选法lacZ lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补,这种互补现象称为之间实现
9、互补,这种互补现象称为-互补互补。具有完整乳糖操纵子的菌体能转译具有完整乳糖操纵子的菌体能转译-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(Z)(Z)、IPTGIPTG和和X-galX-gal时,产生兰色沉淀物,使菌落时,产生兰色沉淀物,使菌落成为蓝色。如果在载体成为蓝色。如果在载体DNADNA上组入上组入-半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因(基因(lacZ)lacZ)部分缺失的片段部分缺失的片段(lacZ(lacZ)则重组则重组DNADNA分子转化分子转化lacZlacZ互补型菌落,会在含有互补型菌落,会在含有X-galX-gal和和IPTGIPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。lac
10、 Zlac Z是是-半乳糖苷酶基因部分缺失的半乳糖苷酶基因部分缺失的DNADNA片段,片段,含含lac Zlac Z的重组载体转化的重组载体转化lac Zlac Z互补型菌株,互补型菌株,可转译可转译-半乳糖苷酶半乳糖苷酶,在含有,在含有X-galX-gal(5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷)和半乳糖苷)和IPTGIPTG(异丙基(异丙基-硫硫代半乳糖苷)代半乳糖苷)的培养基上使转化子成为蓝色菌落,的培养基上使转化子成为蓝色菌落,而而lac Zlac Z互补型菌株本身为白色菌落互补型菌株本身为白色菌落。当。当lac lac Z Z区插入外源基因后,再转化区插入外源
11、基因后,再转化lac Zlac Z互补型菌互补型菌株,由于不能翻译株,由于不能翻译-半乳糖苷酶,转化子即使在半乳糖苷酶,转化子即使在含有含有X Xgalgal和和IPTGIPTG的培养基上也只能长成白色菌的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。转化子。此方法主要用于原核生物。此方法主要用于原核生物。互互补补的的检检测测以显色剂以显色剂x-galx-gal作为选择物时作为选择物时:DNADNA对照组对照组不应出现任何菌落;不应出现任何菌落;感受态细胞对照组长感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色出的菌落应全是蓝色的;的;
12、感受态细胞有效性对照组长感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应出的菌落中应有白色的。有白色的。其中一项不符,就有可能挑出假的转化子其中一项不符,就有可能挑出假的转化子菌落。菌落。(5)利用报告基因筛选植物转化细胞报告基因:报告基因:系指系指其编码产物其编码产物能够被快速地测定,能够被快速地测定,常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞(器官或组织)并检测其表达活性的一类特殊胞(器官或组织)并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。用途的基因。在在植物转基因植物转基因研究中,在有选择压力的情况下,研究中,在有选择压力的情况下,可利用报告基因在受体细胞内的表
13、达,从大量非可利用报告基因在受体细胞内的表达,从大量非转化克隆中选择出转化细胞;同时,报告基因可转化克隆中选择出转化细胞;同时,报告基因可以和某些目的基因构成以和某些目的基因构成嵌合基因嵌合基因,从报告基因的,从报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他持殊产物的基因等某些酶类或其他持殊产物的基因等。特征特征作为报告基因,在遗传选择和筛选检作为报告基因,在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件:测方面必须具有以下几个条件:(1)(1)已被克隆
14、和全序列已测定;已被克隆和全序列已测定;(2)(2)表达产物在受体细胞中本不存在,表达产物在受体细胞中本不存在,即无背景,在被转染的细胞中无相似的内即无背景,在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;源性表达产物;(3)(3)其表达产物能进行定量测定。其表达产物能进行定量测定。新霉素磷酸转移酶基因(新霉素磷酸转移酶基因(nptnpt)抗新霉素、卡抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和那霉素、庆大霉素和G418G418等抗生素,成为筛选动等抗生素,成为筛选动植物转化子的选择标记基因。植物转化子的选择标记基因。潮霉素磷酸转移酶基因(潮霉素磷酸转移酶基因(hpthpt)赋予转化子能抗赋予转化子能抗潮霉素,作为
15、选择标记基因主要用于筛选动植物潮霉素,作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。转化子。潮霉素是致癌物质,操作时应慎重潮霉素是致癌物质,操作时应慎重。氯霉素乙酰转移酶基因(氯霉素乙酰转移酶基因(catcat)也被用于筛选动也被用于筛选动植物转化子的标记基因。植物转化子的标记基因。-葡萄糖酸酶基因(gus)gusgus的基因产物的基因产物-葡萄糖酸酶葡萄糖酸酶(GUSGUS)能够催化能够催化4-4-甲基伞形花酮甲基伞形花酮-D-D-葡萄糖苷酸,葡萄糖苷酸,产生荧光物质产生荧光物质4-4-甲基伞形花酮,以此筛选含甲基伞形花酮,以此筛选含gusgus基因的转化子。基因的转化子。由于植物细胞由于植物细
16、胞GUSGUS本底非常低,因此广泛地应用于本底非常低,因此广泛地应用于筛选植物转化子。筛选植物转化子。尤其是尤其是gusgus基因的基因的3 3端与其他结构基因连接产生端与其他结构基因连接产生的的嵌合基因嵌合基因仍能正常表达,产生的仍能正常表达,产生的融合蛋白融合蛋白中仍中仍有有GUSGUS活性,可用于外源基因在转化生物体中的定活性,可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。位分析。萤火虫荧光素酶基因(luc)lucluc表达产物表达产物萤火虫荧光素酶(萤火虫荧光素酶(LUCLUC)在)在MgMg2+2+的作用的作用下,下,可以与荧光素和可以与荧光素和ATPATP底物发生反应,底物发生反应,形成
17、形成与酶结与酶结合的合的腺苷酸荧光素酰化复合物,腺苷酸荧光素酰化复合物,经过氧化脱羧作用经过氧化脱羧作用后,后,该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素,该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素,可以用可以用荧光测定仪荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光,快速灵敏地检测出产生的荧光,是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。LucLuc基因检测十分迅速,灵敏度高,成本低,不存在基因检测十分迅速,灵敏度高,成本低,不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害,也没有内源荧光产生的背景干扰,因此,危
18、害,也没有内源荧光产生的背景干扰,因此,LucLuc是是一种理想的报告基因一种理想的报告基因。抗除草剂抗除草剂barbar基因。基因。barbar基因编码磷化乙酰转移基因编码磷化乙酰转移酶(酶(PATPAT),使转化子对含有磷化麦黄酮(),使转化子对含有磷化麦黄酮(PPTPPT)成分的除草剂具有抗性。成分的除草剂具有抗性。冠瘿碱合成酶基因。冠瘿碱合成酶基因。主要包括主要包括胭脂碱合成酶基因胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因和章鱼碱合成基因两类,存在于土壤农杆菌两类,存在于土壤农杆菌TiTi质粒质粒的的T-DNAT-DNA区段。区段。冠冠瘿瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催碱合成酶基因在植
19、物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应,通过电泳分离及菲醌荧光染料染化一些特殊反应,通过电泳分离及菲醌荧光染料染色,方便地观察,据此作为报告基因用于转植物基色,方便地观察,据此作为报告基因用于转植物基因细胞的筛选。因细胞的筛选。冠冠瘿瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多,碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多,现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。(6)利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 在植物转基因研究中采用的在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移氯霉素乙酰转移酶酶(Cat)(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶基因和新霉素磷酸转移酶(Npt)(N
20、pt)基基因因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。常用的标记基因还有:常用的标记基因还有:-胸腺核苷激酶基因(胸腺核苷激酶基因(tktk)、)、-二氢叶酸还原酶基因(二氢叶酸还原酶基因(dhfrdhfr)-次黄嘌呤次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(hgprthgprt)-细菌的黄嘌呤细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因基因(ecogpt)(ecogpt)等。等。胸腺核苷激酶基因(胸腺核苷激酶基因(tktk)、二氢叶酸还原酶基因)、二氢叶酸还原酶基因(dhfrdhfr)及次黄嘌呤)及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
21、基因鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(hgprthgprt)等的)等的表达产物直接或间接参与核苷酸合表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。成代谢。这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡,只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生而死亡,只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。长。如果用这样的如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞缺陷型细胞作为受体细胞,导入含有,导入含有上述基因的外源上述基因的外源DNADNA,补充原来缺失的基因,使核,补充原来缺失的基因,使核苷酸合成代谢恢复正常,可以苷酸合成代谢恢复正常,可以在不添加核苷酸的培在不添加核苷酸的培养基养基中
22、正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。酸的培养基中筛选出转化子。三、核酸分子杂交检测法三、核酸分子杂交检测法(p239)基本原理基本原理复性复性RNADNA待测的核酸序列待测的核酸序列杂交的双方杂交的双方用于检测的已知核酸片段用于检测的已知核酸片段探针探针 根据待测核酸的来源以及将其分子结根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同。合到固相支持物上的方法的不同。SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交斑点和狭线印迹杂交斑点和狭线印迹杂交菌落(或噬菌体)原位
23、杂交菌落(或噬菌体)原位杂交核酸分子杂交检测法分类核酸分子杂交检测法分类又称又称DNA印迹杂交、印迹杂交、Southern DNA印迹杂交印迹杂交1、Southern印迹杂交印迹杂交经琼脂糖凝胶电泳分离的经琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段片段转移到滤膜上转移到滤膜上 与标记的与标记的DNA或或RNA探针杂交探针杂交放射自显影显杂交带放射自显影显杂交带基本原理:基本原理:(1)提取总)提取总DNA(2)酶解)酶解(3)电泳)电泳(4)转印)转印(5)变性解链)变性解链(6)杂交)杂交(7)洗脱)洗脱(8)放射自显影)放射自显影(9)比较分析)比较分析 毛细管虹吸印迹法电转移印迹法真空转移法核酸转移
24、(印迹)方法核酸转移(印迹)方法毛细管虹吸印迹法毛细管虹吸印迹法湿滤纸湿滤纸高盐缓冲液高盐缓冲液滤纸桥滤纸桥凝胶凝胶硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板支持台支持台容器容器重物重物利用核酸分子在电场中的利用核酸分子在电场中的电泳作用电泳作用将凝胶中将凝胶中的的DNADNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。湿式电转移湿式电转移干式电转移干式电转移电转移法电转移法尼龙膜尼龙膜凝胶凝胶滤纸滤纸海绵海绵凝胶支持夹凝胶支持夹缓冲液缓冲液电极电极+滤纸滤纸电极电极湿式湿式电转移法电转移法真空转移法真空转移法真空转移装置真空转移装置硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜(简称(简称NCNC膜)膜)优点:
25、优点:吸附能力强,杂交吸附能力强,杂交信号本底低信号本底低缺点:缺点:DNADNA分子结合不牢分子结合不牢固,膜易碎裂,依赖高盐固,膜易碎裂,依赖高盐溶液溶液常用的固相支持物常用的固相支持物尼龙膜(尼龙膜(NylonNylon)优优点:点:结合单链,双链结合单链,双链DNA的能力比的能力比NC膜强,膜强,韧性高,可重复杂交韧性高,可重复杂交缺点:缺点:杂交信号本底高杂交信号本底高常用的固相支持物常用的固相支持物凝胶凝胶滤膜滤膜转移转移RNA 至膜上至膜上RNA 分子分子甲醛变性电甲醛变性电泳(聚丙烯泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)酰胺凝胶电泳)带有带有RNA片段的凝胶片段的凝胶转膜转膜杂交杂交、显影显
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 目的 基因 导入 受体 细胞
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【w****g】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【w****g】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。