目的基因筛选与DNA文库构建.pptx
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1、第六章目的基因筛选与DNA文库的构建目的基因的获得目的基因的获得1.基因文库(genelibrary);2.从物种的基因组或cDNA中PCR 扩增;3.人工合成基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因准备要分离、改造、扩增或表达的基因 基因文库(基因文库(Gene library):):由大量的含有基因组DNA(即某一生物的全部DNA序列)的不同DNA片段的克隆所构成的群体,称之为基因文库。一个完全的基因文库,应该能够保证从中筛选到目的基因。即Genomiclibrary基因组基因组 DNA 文库:文库:指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段,与合
2、适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。按照外源DNA的片段:基因组DNA文库和cDNA文库包含基因的全部信息,如编码区,非编码区,内含子和外显子、启动子及调控序列cDNA文库文库:complementaryDNA互补DNA由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA,它们所构成的重组DNA克隆群体,则称之为cDNA基因文库。反映了基因表达普,对研究基因表达,调控及基因互作非常有用。基因组基因组 DNA 文库的构建程序:文库的构建程序:1、载体的制备;2、高纯度大分子量基因组 DNA(HighmolecularweightDNA,HMWDNA)的提取
3、;3、HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离(PFGEsizeselection);4、载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞;5、重组克隆的挑取和保存。构建噬菌体文库,连接产物不用电转化的方法转化宿主,而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。文库的代表性和随机性文库的代表性和随机性代表性代表性文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组,即可以从该文库中分离任何一段DNA。采用酶切或随机切割的方法来消化染色体DNA,以保证克隆的随机性,保证每段DNA在文库中出现的频率均等;增加文库总容量。外源片段大小和重组克隆数量1976年L.Clark,J.Carbon提出了一个完全
4、的基因文库所需克隆的计算公式n=ln(1-p)/ln(1-f)n:一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率f:插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值哺乳动物3109kb若p=99%平均克隆片段20kbf=20kb/3109n=690773.2E.coli 4,639,221bpp=99%f=20kb/4600kbn=1056.9p=99%f=10kb/4600kbn=2116一、用于构建基因文库的载体第一节基因组DNA文库的构建可装载的外源DNAPlasmid10kbPhage0-23kbCosmid45kbBAC100kbYAC300kb-1.2M
5、b粘粒克隆所需的克隆子数是phage的一半,如需700000时,cosmid需350000个。噬菌体改建的,利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点;经改造的质粒载体或人工染色体,其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源片段。YAC可用于克隆500kb以上,甚至几Mb的DNA片段BAC可减少DNA分子间的重组置换型载体coscosRLCentralstuffer1 phage vectors 目前用EMBL系列,2001,DASH,Charon 38-40,GEM-11 等置换型载体,插入片段的最大值可达20-24kb有利于分子杂交进行筛选43kb,左臂、右臂和填充片段的大小分别为2
6、0kb、9kb和14kb。克隆DNA片段的大小为9-23kb。2Cosmidvector(柯斯质粒)由噬菌体的cos序列、质粒的复制序列及抗生素抗性基因 所有cosmid vector均可用于构建文库。cos序列:噬菌体DNA的包装序列T4噬菌体DNA连接酶多连体分子二、用phage构建文库1总DNA的提取DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍,否则有效片段较少,因此DNA至少应大于100kb(cosmid200kb)2载体臂的制备购买载体制备、纯化限制酶消化BamHI/EMBLXhoI/GEM-11载体臂的纯化(梯度离心:蔗糖或NaCl)梯度离心的收获量大,而agarose回收量小回收无
7、填充片段聚乙二醇沉淀,除去碎片置换型载体coscosRLCentralstuffer3基因组DNA的消化一般采用Sau3AI消化回收20-24kb(agarose法or梯度离心)有些载体可做不完全补平4连接/包装连接形成较长的多联体,包装成粘粒(46个月稳定)5扩增和保存重组phage可在E.coli中扩增,所得文库可被长时间利用和贮存,可用于多个不同基因的筛选6在宿主菌上形成噬菌斑7带有目的外源DNA序列的phage重组体的鉴定8对选出的重组phage进行噬斑纯化,再对外源DNA进行分析载体的去磷酸化,提高连接和包装效率双酶切消化载体(EMBL系列,2001,XDASH,Charson40,
8、35,34)EMBL3A:SalIBamHIEcoRI-E1B1-S1连接反应中,应测定外源片段与载体的比例phage108pfu/gDNA若用BamHI和EcoRI双酶切,可用异丙醇沉淀或其它柱层析法去除小片段,使非重组体的数目降低2个数量级,结合其它方法如Spi筛选可再降低2-3个数量级基因组DNA片段3凹端的不完全补平-GATC-CTAG-GATC-CTAG-Sau3AI-GAGATC-CTAGAG-KlenowdATP/dGTP-CTCGAG-GAGCTC-XhoIKlenowdCTP/dTTP-CTCTCGAG-GAGCTCTC-互补GEM-11基因组DNAVector三、重组体的筛
9、选和分析噬斑原位杂交将噬菌体以一定密度铺于平板,并影印到固相膜上要从哺乳动物DNA文库里筛选出目标基因,哺乳动物基因组复杂度为3109bp,必须筛选几十万个噬斑不同大小的培养皿所能容纳的噬斑数目.杂交筛选用探针.纯化.分析/Southern杂交,酶切Sequencing/其它方法,如免疫学方法四、亚基因组文库的构建用基因组DNA的特定部分所构建的基因文库质粒DNA,线粒体DNA,特定限制性片段在有杂交探针的情况下,可通过Southern杂交,先找出目标基因所在的限制性片段的大小,然后用相应大小的限制性DNA片段构建出基因文库,这样可减少筛选的压力。例如将基因组DNA用多种限制性内切酶切割,通过
10、Southern杂交则将SpeI切割的基因组DNA中的8.3kb片段回收,用于构建DNA文库发现目标基因在8.3kbSpeI片段上哺乳动物3109kb若p=99%平均20kbn=690773.2E.coli 4639221bpp=99%平均10kbn=2134若用占总DNA1/10区域的限制性片段,则n=69075若用占总DNA1/10区域的限制性片段(10kb),则n=199一、cDNA克隆用的mRNA第二节cDNA文库的构建1.mRNA的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力无细胞翻译体系(源于网织红细胞)哺乳动物总mRNA可编码10100kDa蛋白指导合成目的多肽的能力利用免疫沉淀和SDS-
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