微生物次生代谢产物研究方法.pptx
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1、微生物次生代谢产物的下游研究方法张翼基本流程菌种菌种发酵培养发酵培养菌体菌体发酵液发酵液前处理、富集提取前处理、富集提取粗提物粗提物分离纯化分离纯化传统方法色谱方法单体化合物单体化合物结构鉴定结构鉴定波谱学手段单晶衍射化学反应活性活性评价、评价、构效构效关系关系活性引导分离或系统分离课程安排n n第一讲:第一讲:发酵、前处理与传统分离方法发酵、前处理与传统分离方法n n第二讲:第二讲:色谱学原理与实际应用色谱学原理与实际应用(1 1)n n第三讲:第三讲:色谱学原理与实际应用色谱学原理与实际应用(2 2)n n第四讲:第四讲:波谱分析概论及紫外、红外、质谱波谱分析概论及紫外、红外、质谱n n第
2、五讲:第五讲:一维与二维核磁共振谱一维与二维核磁共振谱n n第六讲:第六讲:核磁共振谱解析实例核磁共振谱解析实例n n第七讲:第七讲:其他结构鉴定常用(波谱)方法其他结构鉴定常用(波谱)方法n n第八讲:第八讲:化合物波谱综合解析实例化合物波谱综合解析实例一、发酵培养与提取1.11.1微生物大规模发酵培养的方式微生物大规模发酵培养的方式 (1(1)液体静置培养(实验室规模)液体静置培养(实验室规模)适用:丝状真菌(三角烧瓶,好氧)适用:丝状真菌(三角烧瓶,好氧)厌氧细菌(密封瓶)厌氧细菌(密封瓶)优点优点:经济,无需专门设备:经济,无需专门设备 缺点缺点:生长相对缓慢:生长相对缓慢第一讲第一讲
3、 发酵、前处理与传统分离方法发酵、前处理与传统分离方法培养基:碳源培养基:碳源/能源、氮源、生长因子、无机盐、水能源、氮源、生长因子、无机盐、水生长曲线及其与次生代谢关系生长曲线及其与次生代谢关系迟滞期、指数期、稳定期、衰亡期迟滞期、指数期、稳定期、衰亡期种子对发酵的影响种子对发酵的影响(2)摇瓶培养(实验室规模)适用:细菌、放线菌、真菌 (厌氧菌不太适宜摇瓶培养,密封 瓶一般体积、重量过大)优点:传质好、溶氧充分,从而生长迅 速、周期短 缺点:要进行大规模发酵需要大量摇床,占用空间大。(3)发酵罐培养 通气发酵罐(好氧细菌、放线菌、真菌)厌氧发酵罐(如啤酒、有机酸、酒精的发 酵生产,次生代谢
4、研究?次生代谢研究?)光生物反应器(光合细菌、微藻)优点:传质效率高、溶氧充分(好氧菌)、温度、pH等参数可控,生长迅速,培养量大 缺点:昂贵(4)固态发酵 适用:丝状真菌与酵母(如醋、酒酿造,豆豉生产等,酶制剂、维生素、生 物毒素、抗生素),现在细菌上也 有应用 优点:供氧充分,散热及时,条件粗放、成本低,下游处理方便 缺点:过程控制、大型化等方面有待改进 1.2发酵液的前处理n n含水多,产物含量低;含水多,产物含量低;n n含菌体及水溶性蛋白;含菌体及水溶性蛋白;n n溶有原来培养基成分;溶有原来培养基成分;n n相当多的副产物和色素;相当多的副产物和色素;n n易被杂菌污染或产物可能会
5、分解;易被杂菌污染或产物可能会分解;n n易起泡,悬浊物及粘性物质(多糖)多。易起泡,悬浊物及粘性物质(多糖)多。n n目标产物目标产物胞内产物(菌体)胞内产物(菌体)胞外产物(发酵液胞外产物(发酵液/水相)水相)1.2.1 1.2.1 发酵液的复杂组成发酵液的复杂组成/特点特点1.2.21.2.2前处理目的、原则与流程前处理目的、原则与流程1)时间短;时间短;2)温度低;温度低;3)pH适中(比较稳妥);适中(比较稳妥);4)生物安全(不可忽视)生物安全(不可忽视)n n固液分离固液分离n n浓缩富集浓缩富集n n目的目的n n原则原则固相(滤渣):菌体及悬浊物等固相(滤渣):菌体及悬浊物等
6、水相:胞外次生代谢产物(与部分水溶性大分子)水相:胞外次生代谢产物(与部分水溶性大分子)n n前处理的一般流程前处理的一般流程也可索氏提取也可索氏提取二、分离与纯化n n活性引导的分离活性引导的分离 对于显示有特定生物活性的粗提物,在分离纯化过程中每一步都用对于显示有特定生物活性的粗提物,在分离纯化过程中每一步都用该筛选模型跟踪分离有活性的组分,直至分离得到具有活性的纯化合物。该筛选模型跟踪分离有活性的组分,直至分离得到具有活性的纯化合物。特别适用于主要对活性成分感兴趣的研究。特别适用于主要对活性成分感兴趣的研究。优点优点:是天然产物化学研究的一个重要的新趋势;:是天然产物化学研究的一个重要的
7、新趋势;能集中精力,有目的性的分离想要得到的活性物质;能集中精力,有目的性的分离想要得到的活性物质;分离和结构解析的工作量相对都较小;分离和结构解析的工作量相对都较小;有清晰的研究思路,对于文章写作有一定好处。有清晰的研究思路,对于文章写作有一定好处。弊端弊端:不能保证有活性的化合物一定为新化合物,有一定风险;有可能:不能保证有活性的化合物一定为新化合物,有一定风险;有可能 会漏掉在该筛选模型中无活性,但有可能具有其他潜在生物活性会漏掉在该筛选模型中无活性,但有可能具有其他潜在生物活性 的新化合物;活性跟踪有时受限于的新化合物;活性跟踪有时受限于“协同效应协同效应”;不方便同时跟;不方便同时跟
8、踪踪 多种活性多种活性两种分离纯化策略两种分离纯化策略活性引导的分离活性引导的分离系统分离系统分离n n系统分离 对于经过或未经过生物活性筛选的提取物,在分离纯化过程中不对于经过或未经过生物活性筛选的提取物,在分离纯化过程中不经筛选模型的跟踪指导,分离纯化所有能够得到的纯化合物,并解析经筛选模型的跟踪指导,分离纯化所有能够得到的纯化合物,并解析结构。最后再根据是否为新化合物及化合物的结构特点,参考相关文结构。最后再根据是否为新化合物及化合物的结构特点,参考相关文献报道或活性预测软件等来进行广泛的生物活性筛选。献报道或活性预测软件等来进行广泛的生物活性筛选。偏重于传统的偏重于传统的天然产物化学研
9、究方法,比较适合冷僻的生物材料和不注重生物活性天然产物化学研究方法,比较适合冷僻的生物材料和不注重生物活性的研究。的研究。优点:优点:不容易漏掉提取物中含有的、能分离到的新化合物,不容易漏掉提取物中含有的、能分离到的新化合物,有利于专利申请、文章撰写,有利于专利申请、文章撰写,也能兼顾各种生物活性。也能兼顾各种生物活性。弊端弊端:目的性不明确:目的性不明确/有一定盲目性;有一定盲目性;分离纯化与结构解析的工作量巨大;分离纯化与结构解析的工作量巨大;波谱测试费用比较大波谱测试费用比较大n n两种方法相结合,以活性引导为主线,兼顾系统分离两种方法相结合,以活性引导为主线,兼顾系统分离基本原则n n
10、尽量快速尽量快速n n低温低温 旋转蒸发(一般低于旋转蒸发(一般低于5050摄氏度);冷冻干燥;样品低温保存摄氏度);冷冻干燥;样品低温保存n n避光避光n n防氧化防氧化 旋转蒸发;有些样品需氮气保护旋转蒸发;有些样品需氮气保护n n溶剂尽量不破坏天然成分溶剂尽量不破坏天然成分 丙酮(与二醇反应成缩酮);乙酸乙酯(成酯);氯仿(酸性)丙酮(与二醇反应成缩酮);乙酸乙酯(成酯);氯仿(酸性)2.1 传统的分离方法(1)萃取/溶剂分配法相似相溶原理相似相溶原理 极性化合物易溶于极性溶剂,非极性化合物易溶于非极性极性化合物易溶于极性溶剂,非极性化合物易溶于非极性溶剂,同类分子或官能团相似的彼此互溶
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