第四节核酸的分子杂交.pptx
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1、第四节第四节 核酸的分子杂交核酸的分子杂交Nucleic Acid HybridizationNucleic Acid Hybridization核酸分子杂交核酸分子杂交:概念:具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下,概念:具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下,按碱基配对原则形成双链的过程。按碱基配对原则形成双链的过程。DNADNA变性方法变性方法:热变性:热变性:9010090100酸碱变性:常采用碱变性酸碱变性:常采用碱变性化学试剂变性:尿素、甲酰胺、甲化学试剂变性:尿素、甲酰胺、甲醛等醛等DNADNA复性或杂交复性或杂交(hybridization)(hybridization)DNA
2、/DNA,DNA/RNA,RNA/RNADNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等等Content of Table一、一、核酸分子杂交技术的原理核酸分子杂交技术的原理二、二、核酸探针的制备核酸探针的制备三、三、核酸探针的标记核酸探针的标记四、四、核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交技术的原理一、核酸分子杂交技术的原理 有互补特定核苷酸序列的单链有互补特定核苷酸序列的单链DNADNA或或RNARNA混在一混在一起时,其相应同源区段将会退火形成双链结构。起时,其相应同源区段将会退火形成双链结构。如把一段如把一段已知基因(已知基因(DNADNA或或RNARNA)的核酸序列用)的核
3、酸序列用合适的标记物(如放射性同位素、生物素等)予合适的标记物(如放射性同位素、生物素等)予以标记,以标记,当作探针(当作探针(probe),probe),与变性后的单链基与变性后的单链基因组因组DNADNA或或RNARNA等进行杂交。等进行杂交。用合适方法(如放射自显影或免疫组织化学等用合适方法(如放射自显影或免疫组织化学等技术)把标记物检测出来,就可确定靶核苷酸序技术)把标记物检测出来,就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。列的拷贝数及表达丰度等。应应 用:用:1 1)检测特定生物有机体之间是否存在)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系;亲缘关系;2 2)用来揭示核酸片段中某一特定基
4、因)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。的存在与否、拷贝数及表达丰度。Home二、核酸探针的制备二、核酸探针的制备探针(探针(Probe):Probe):一段带有检测标记的与目的基一段带有检测标记的与目的基因或目的因或目的DNA特异互补的已知核特异互补的已知核苷酸序列。苷酸序列。探针的制备方法探针的制备方法探针长度一般以探针长度一般以50300bp为宜。为宜。制备方法:制备方法:1)利用)利用DNA重组技术重组技术2)PCR扩增扩增3)化学合成)化学合成探针的分类:探针的分类:据制备方法及核酸性质不同,可分为:据制备方法及核酸性质不同,可分为:1 基因组基因组DNA探针
5、探针2 cDNA探针探针3 RNA探针探针4 寡核苷酸探针寡核苷酸探针合成寡核苷酸探针注意原则:合成寡核苷酸探针注意原则:1 1)长度()长度(10-50 bp);10-50 bp);2)G:C2)G:C对含量对含量40%-60%40%-60%;3 3)探针内避免互补;)探针内避免互补;4 4)避免同一碱基连续出现;)避免同一碱基连续出现;5 5)与非靶序列有)与非靶序列有70%70%以上同源性或连续以上同源性或连续8 8个以上碱基序列相同,最好不用。个以上碱基序列相同,最好不用。Home三、核酸探针的标记三、核酸探针的标记 为确定探针是否与相应基因组为确定探针是否与相应基因组DNADNA杂杂
6、交,有必要对探针加以标记,以便在交,有必要对探针加以标记,以便在结合部位获得可识别的信号。结合部位获得可识别的信号。1、标记的种类、标记的种类同位素:同位素:3232P P、3535S S、3 3H H、125125I I等标记探针等标记探针非同位素:非同位素:生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较:后者不及前者敏感,但后者保两者比较:后者不及前者敏感,但后者保存时间较长,无同位素污染。存时间较长,无同位素污染。一个理想的标记物:1 1)标记前后探针的基本结构、化学性)标记前后探针的基本结构、化学性质相同质相同;2 2)特异性强、本底低、重复性好
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