第二章10基因工程基因文库的构建.pptx

第六部分第六部分 基因文库的构建基因文库的构建一、基因文库的概述一、基因文库的概述二、基因组二、基因组DNA文库的构建文库的构建三、三、cDNA文库的构建文库的构建1、基因文库、基因文库(gene library)概念概念是是指指将将某某种种生生物物的的全全部部基基因因组组的的遗遗传传信信息息贮贮存存在在可可以以长长期期保保存存的的稳稳定定的的重重组组体体中中，以以备备需需要要时时能能够够随随时时应应用用它它分分离离所所需需要要的的目目的的基基因因，这这种种保保存存基基因因遗遗传传信信息息的的材材料料，就就称称为为基基因因文文库库又称又称DNA文库。文库。基基因因文文库库由由外外源源DNA片片段段、载载体体和和宿宿主主细细胞胞组组成。成。一、一、基因文库的概述基因文库的概述2 2、基因文库的分类、基因文库的分类基基因因组组DNADNA：提提取取的的染染色色体体基基因因组组DNADNA。如如果果要要研研究究的的是是控控制制基基因因表表达达的的调调控控序序列列，或或是是在在mRNAmRNA中中不不存存在在的的某某种种特特定定序序列列，有有关关这这类类的的信信息息就就只只能能从从染染色色体基因组体基因组DNADNA中获得。中获得。cDNAcDNA：mRNAmRNA反反转转录录成成的的cDNA cDNA。如如果果研研究究的的目目标标是是弄弄清清一一种种蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸顺顺序序，可可以以根根据据克克隆隆的的cDNAcDNA分子的核苷酸序列直接推导出来。分子的核苷酸序列直接推导出来。基因组文库（基因组文库（genomic librarygenomic library）含有全部基因。）含有全部基因。cDNAcDNA文文库库（cDNA cDNA librarylibrary）含含有有全全部部蛋蛋白白质质编编码码的的结构基因。结构基因。用用用用鸟枪法鸟枪法鸟枪法鸟枪法构建基因组文库，材料来自构建基因组文库，材料来自构建基因组文库，材料来自构建基因组文库，材料来自染色体染色体染色体染色体DNADNA。用用用用cDNAcDNA法法法法构建构建构建构建cDNAcDNA文库，材料来自文库，材料来自文库，材料来自文库，材料来自mRNAmRNA。在在在在高高高高度度度度分分分分化化化化的的的的生生生生物物物物体体体体中中中中，不不不不同同同同组组组组织织织织和和和和细细细细胞胞胞胞在在在在不不不不同同同同时时时时段段段段的的的的mRNAmRNA种种种种类类类类不不不不同同同同（即即即即基基基基因因因因的的的的表表表表达达达达谱谱谱谱不不不不同同同同），因因因因此此此此同同同同种种种种生生生生物物物物体体体体的的的的cDNAcDNA文文文文库库库库一一一一般般般般还还还还有有有有组组组组织织织织细细细细胞胞胞胞的的的的界界界界定定定定，如如如如肝肝肝肝组组组组织织织织cDNAcDNA文文文文库库库库或或或或胚胚胚胚胎胎胎胎组组组组织织织织cDNAcDNA文文文文库库库库等等等等。很很很很显显显显然然然然，cDNAcDNA文库的信息量远小于基因组文库。文库的信息量远小于基因组文库。文库的信息量远小于基因组文库。文库的信息量远小于基因组文库。(1)(1)基因组文库基因组文库(Genomic library)(Genomic library)是是指指将将某某种种生生物物体体的的全全部部基基因因组组DNADNA用用限限制制性性内内切切酶酶或或机机械械力力量量切切割割成成一一定定长长度度范范围围的的DNADNA片片段段，再再与与合合适适的的载载体体在在体体外外重重组组并并转转化化相相应应的的宿宿主主细细胞胞获获得得的的所所有有阳阳性性菌菌落落，这这个个群群体体就就称称为为该该生生物物基基因组文库。因组文库。目目的的是是分分离离有有用用的的目目的的基基因因和和保保存存某某种种生生物物的的全全部部基因。基因。基基因因组组文文库库根根据据DNADNA来来源源分分为为：核核基基因因组组文文库库、叶叶绿体基因组文库、线粒体基因组文库。绿体基因组文库、线粒体基因组文库。克隆外源克隆外源 DNA片段的切割主要采用片段的切割主要采用机械断裂或限机械断裂或限制性部分酶解制性部分酶解两种方法，其基本原则：两种方法，其基本原则：DNA 片段之间存在部分重叠序列。片段之间存在部分重叠序列。DNA 片段大小均一。片段大小均一。(2)cDNA(2)cDNA文库文库 (cDNA library)(cDNA library)：是指将某种生物体某一发育时期所转录的全部是指将某种生物体某一发育时期所转录的全部mRNAmRNA经反转录形成的经反转录形成的cDNAcDNA片段与某种载体连接而形成的片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。克隆的集合。cDNA(complementary DNAcDNA(complementary DNA，互补，互补DNA)DNA)：是由生物的：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNAmRNA经体外经体外反转录后形成的互补反转录后形成的互补DNADNA。基因组文库与基因组文库与cDNAcDNA文库的最大区别：文库的最大区别：基因组文库含有而基因组文库含有而cDNAcDNA文库不含有文库不含有非转录的基因组非转录的基因组序列。序列。2024/8/12 周一63 3、构建基因文库的基本方法、构建基因文库的基本方法将将特特定定生生物物体体的的因因组组DNADNA或或cDNAcDNA分分解解成成适适当当大大小小的的DNADNA片片段段,然然后后分分别别与与克克隆隆载载体体连连接接成成重重组组DNADNA分子。分子。通通过过转转化化或或转转导导的的方方法法将将带带有有不不同同DNADNA片片段段的的重重组组DNADNA分分子子导导入入受受体体细细胞胞，获获得得一一套套包包含含特特定定生生物体所有物体所有DNADNA序列的克隆。序列的克隆。二、基因组文库的构建二、基因组文库的构建(一一)基因组文库的类型基因组文库的类型根据所选用的载体可以分为：根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）。体文库等）。(二二二二)基因文库的完备性基因文库的完备性基因文库的完备性基因文库的完备性基基基基因因因因文文文文库库库库的的的的完完完完备备备备性性性性是是是是指指指指：在在在在构构构构建建建建的的的的基基基基因因因因文文文文库库库库中中中中任任任任一一一一基基基基因因因因存存存存在在在在的的的的概概概概率率率率，它它它它与与与与基基基基因因因因文文文文库库库库最最最最低低低低所所所所含含含含克克克克隆隆隆隆数数数数N N N N之之之之间的关系可用下式表示：间的关系可用下式表示：间的关系可用下式表示：间的关系可用下式表示：N=ln(1 P)/ln(1 f)N=ln(1 P)/ln(1 f)（三）基因组（三）基因组DNADNA文库的质量标准文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因组除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因组DNADNA文库应具备下列条件：文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分 隔克隆。隔克隆。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以 利于克隆排序。利于克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。(四四)基因组文库构建的一般步骤基因组文库构建的一般步骤 载体的选择和制备。载体的选择和制备。高纯度、大分子量基因组高纯度、大分子量基因组 DNA DNA 的提取。的提取。基因组基因组 DNA DNA 的部分酶切与分级分离。的部分酶切与分级分离。载体与载体与DNADNA片段的连接。片段的连接。转化或侵染宿主细胞。转化或侵染宿主细胞。筛选鉴定基因组及保存。筛选鉴定基因组及保存。载体和受体的选择载体和受体的选择载体和受体的选择载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的通常选装载量较大的通常选装载量较大的通常选装载量较大的 -DNA-DNA-DNA-DNA或考斯质粒；对于大型基因或考斯质粒；对于大型基因或考斯质粒；对于大型基因或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用组（如动植物和人类）需使用组（如动植物和人类）需使用组（如动植物和人类）需使用YACYACYACYAC或或或或BACBACBACBAC载体由于绝大多载体由于绝大多载体由于绝大多载体由于绝大多数真核生物的数真核生物的数真核生物的数真核生物的mRNAmRNAmRNAmRNA小于小于小于小于10 10 10 10 kbkbkbkb，因此用于因此用于因此用于因此用于cDNAcDNAcDNAcDNA文库构建文库构建文库构建文库构建的载体通常选质粒或的载体通常选质粒或的载体通常选质粒或的载体通常选质粒或 -DNA-DNA-DNA-DNA上述几种载体的最大装载量如下：上述几种载体的最大装载量如下：上述几种载体的最大装载量如下：上述几种载体的最大装载量如下：用于基因用于基因用于基因用于基因文库构文库构文库构文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA的制备的制备的制备的制备为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性，用于用于用于用于基因组文库构建的基因组文库构建的基因组文库构建的基因组文库构建的DNADNADNADNA在分离纯化操作中应尽量避免过在分离纯化操作中应尽量避免过在分离纯化操作中应尽量避免过在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的度的断裂。制备的度的断裂。制备的度的断裂。制备的DNADNADNADNA分子量越大（至少是插入片断大分子量越大（至少是插入片断大分子量越大（至少是插入片断大分子量越大（至少是插入片断大小的小的小的小的3 3 3 35 5 5 5倍），文库的重组率和完备性也就越高。倍），文库的重组率和完备性也就越高。倍），文库的重组率和完备性也就越高。倍），文库的重组率和完备性也就越高。用常规方法制备的染色体用常规方法制备的染色体用常规方法制备的染色体用常规方法制备的染色体DNADNADNADNA的长度一般在的长度一般在的长度一般在的长度一般在100 100 100 100 kbkbkbkb左右左右左右左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDSSDSSDSSDS蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K K K、RNaseARNaseARNaseARNaseA的缓冲液中浸泡，可获得的缓冲液中浸泡，可获得的缓冲液中浸泡，可获得的缓冲液中浸泡，可获得 100 kb100 kb100 kb100 kb大大大大小的小的小的小的DNADNADNADNA片段。片段。片段。片段。AAAAAAAA基因组基因组基因组基因组DNADNA的切割的切割的切割的切割用用用用于于于于基基基基因因因因组组组组文文文文库库库库构构构构建建建建的的的的DNADNA片片片片段段段段的的的的切切切切割割割割一一一一般般般般采采采采用用用用超超超超声声声声波波波波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：保证保证保证保证DNADNA片段之间存在部分重叠区。片段之间存在部分重叠区。片段之间存在部分重叠区。片段之间存在部分重叠区。保证保证保证保证DNADNA片段大小均一。片段大小均一。片段大小均一。片段大小均一。超声波处理后的超声波处理后的超声波处理后的超声波处理后的DNADNA片段呈平头末端，需加装人工接头。片段呈平头末端，需加装人工接头。片段呈平头末端，需加装人工接头。片段呈平头末端，需加装人工接头。部部部部分分分分酶酶酶酶切切切切法法法法一一一一般般般般选选选选用用用用4 4碱碱碱碱基基基基识识识识别别别别序序序序列列列列的的的的限限限限制制制制性性性性内内内内切切切切酶酶酶酶，如：如：如：如：Sau3ASau3A或或或或MboIMboI等，这样等，这样等，这样等，这样DNADNA酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控连连连连接接接接前前前前，上上上上述述述述处处处处理理理理的的的的DNADNA片片片片段段段段必必必必须须须须根根根根据据据据载载载载体体体体的的的的装装装装载载载载量量量量进进进进行行行行分分分分级级级级分分分分离离离离，以以以以杜杜杜杜绝绝绝绝不不不不相相相相干干干干的的的的DNADNA片片片片段段段段随随随随机机机机连连连连为为为为一一一一体体体体！载体与载体与载体与载体与DNADNADNADNA片段的连接片段的连接片段的连接片段的连接在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前先使用小体系连接来寻找最佳比例！先使用小体系连接来寻找最佳比例！先使用小体系连接来寻找最佳比例！先使用小体系连接来寻找最佳比例！方法一：粘末端连接方法一：粘末端连接方法一：粘末端连接方法一：粘末端连接方法二：人工接头法方法二：人工接头法方法二：人工接头法方法二：人工接头法转化或侵染宿主细胞转化或侵染宿主细胞转化或侵染宿主细胞转化或侵染宿主细胞在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效率高的。率高的。率高的。率高的。进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！（五）基因组文库构建的技术性问题（五）基因组文库构建的技术性问题（五）基因组文库构建的技术性问题（五）基因组文库构建的技术性问题在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源严禁外源严禁外源严禁外源DNADNADNADNA片段之间的连接！片段之间的连接！片段之间的连接！片段之间的连接！为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：将待连接的将待连接的将待连接的将待连接的DNADNADNADNA片段根据载体的装载量分级分离。片段根据载体的装载量分级分离。片段根据载体的装载量分级分离。片段根据载体的装载量分级分离。用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去DNADNADNADNA片段的末端磷酸基团。片段的末端磷酸基团。片段的末端磷酸基团。片段的末端磷酸基团。在在在在DNADNADNADNA片段的末端添加人工接头片段的末端添加人工接头片段的末端添加人工接头片段的末端添加人工接头 。（六）构建基因组文库应注意的问题（六）构建基因组文库应注意的问题构构建建一一个个文文库库，插插入入DNADNA和和载载体体DNADNA的的质质量量是是成成功功与与否否的的关关键键。基基因因组组DNADNA应应当当非非常常纯纯以以适适应应DNADNA的的酶酶解解，而而且且基基因因组组DNADNA也也应应足足够够大大（最最好好超超过过200kb200kb）以获得两个末端的消化产物。）以获得两个末端的消化产物。不不论论是是载载体体DNADNA还还是是靶靶DNADNA不不含含外外源源片片段段是是一一个个基基本本条条件件。污污染染少少量量探探针针顺顺序序或或载载体体的的基基因因组组DNADNA将将引引起起很很大大麻麻烦烦，这这是是因因为为在在筛筛选选过过程程中中它它们们将将被鉴定为所要的克隆。被鉴定为所要的克隆。部部分分消消化化产产品品应应当当是是一一组组覆覆盖盖整整个个基基因因组组的的随随机机片片段段。识识别别4个个碱碱基基的的限限制制酶酶要要比比识识别别6个个碱碱基基酶酶能能产产生生更更随随机机的的插插入入片片段段。部部分分消消化化所所产产生生的的片片段段应应能能连连接接到到设设定定的的载载体体上上。限限制制酶酶和和部部分分消消化化过过程程应应事事先先检检查查。一一些些批批次次的的酶酶质质量量不不够够高高而而导导致致产产生生的的DNA片片段段末末端端不不能能有有效效地地连连接接。如如果果预预期期结结果果没没有有出出现现，检检查查限限制制酶酶和和DNA浓度及纯度。浓度及纯度。在在考考虑虑把把噬噬菌菌体体臂臂和和插插入入DNA片片段段连连接接过过程程中中有有两两个个重重要要参参数数：噬噬菌菌臂臂和和潜潜在在插插入入片片段段的的比比例例、基基因因组组DNA的的浓浓度度和和纯纯度度。大大约约10pg噬噬菌菌臂臂和和4gDNA能能产产生生有有效效地地包包装装。对对一一个个典典型型的的基基因因组组要要产产生生一一个个可表达文库，重组子数一般要大于可表达文库，重组子数一般要大于11066l06。包包装装抽抽提提物物的的包包装装效效率率贮贮存存于于液液氮氮中中可可保保持持1年年多多。而而在在-70中中只只能能保保存存几几星星期期，而而且且包包装装效效率率还还会会降降低低。由由于于包包装装抽抽提提物物的的质质量量是是一一个个关关键键性性因因素素，商商业业性性包包装装抽抽提提物物，例例如如Gigapack（Stratagene），都都已已有有商商售售。这这种种包包装装提提取取物物质质量量高高，且且在在体体外外包包装装噬菌体噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。（七（七)原核生物基因组文库的构建原核生物基因组文库的构建1 1、原核生物基因组的提取、原核生物基因组的提取染色体染色体DNADNA质粒质粒DNADNA要求：制备的要求：制备的DNADNA的长度为的长度为100-200kb100-200kb。防止在制备过程中的机械断裂。防止在制备过程中的机械断裂。2 2、酶切片段与载体连接、酶切片段与载体连接酶切片段及分离、纯化酶切片段及分离、纯化基因组的不完全酶切基因组的不完全酶切根据实验需要选择合适的限制性内切酶根据实验需要选择合适的限制性内切酶 四个识别位点的限制酶出现的几率四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256:1/256 六个识别位点的限制酶出现的几率六个识别位点的限制酶出现的几率:1/1024:1/1024分离目的酶切片段大小的确定分离目的酶切片段大小的确定 克隆单个基因：克隆单个基因：10 kb 10 kb 克隆基因族：克隆基因族：20kb 20kbDNADNA不完全酶切条件的确定不完全酶切条件的确定 确定限制酶用量，改变酶切时间确定限制酶用量，改变酶切时间 固定酶切时间，改变限制酶的用量固定酶切时间，改变限制酶的用量DNADNA的不完全酶切的不完全酶切酶切片段回收酶切片段回收低熔点琼脂糖回收目的片段低熔点琼脂糖回收目的片段试剂盒回收目的片段试剂盒回收目的片段酶切片段与克隆载体连接酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择：克隆载体的选择：质粒载体可承载质粒载体可承载15kb DNA15kb DNA左右片段左右片段 载体可承载载体可承载25kb DNA25kb DNA左右片段左右片段Cosmid Cosmid 载体可承载载体可承载45kb DNA45kb DNA左右片段左右片段3 3、重组、重组DNADNA转化受体细胞转化受体细胞根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：常见的宿主细胞：DH5DH5、HB101HB101、JM101JM101、JM109JM109重组质粒转化受体细胞重组质粒转化受体细胞1 1）转化法）转化法(transformation)(transformation)2 2）转染法）转染法(transfection)(transfection)3 3）转导法）转导法(transduction)(transduction)4、基因组、基因组DNA文库克隆子保存与筛选文库克隆子保存与筛选基因组基因组DNA文库的保存文库的保存文库在液体培养基中扩增保存文库在液体培养基中扩增保存方方法法：从从琼琼脂脂糖糖平平板板上上挑挑取取已已长长出出的的克克隆隆子子转转入入含含适适当当的的抗抗生生素素培培养养基基中中，混混合合的的细细菌菌生生长长数数代代后后，其其培培养养物物于于-80储储存存（加加终终浓浓度度为为25%的甘油）。的甘油）。缺缺点点：因因文文库库菌菌落落生生长长的的不不均均匀匀性性而而导导致致文文库库中某些特定的序列过多或过少。中某些特定的序列过多或过少。保存单个克隆子于含有甘油的培养基中保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选方法：从平板上挑选单个克隆子单个克隆子接种于合适的含抗接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为浓度为25%25%的甘油，于的甘油，于-80-80保存。保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。基因组文库的筛选基因组文库的筛选表表型型筛筛选选法法：表表达达性性状状易易于于鉴鉴别别，如如互互补补筛筛选选。抗抗性性筛筛选选法法：如如二二氢氢叶叶酸酸还还原原酶酶可可以以使使三三甲甲苄苄。二二氨氨嘧嘧啶啶降降解解，而而该该化化学学物物可可抑抑制制大大肠肠杆杆菌菌生生长长。分分子子杂杂交交法法：利利用用分分子子探探针针对对文文库库进进行行筛筛选选。免免疫疫筛筛选选法法：利利用用多多肽肽等等作作为为抗抗原原进进行行原原位位杂杂交交 筛选。筛选。P PC CR R筛筛选选法法：根根据据保保守守序序列列合合成成引引物物,扩扩增增特特异异性性 片段。片段。从基因文库中迅速准确地锁定目的基因至关重从基因文库中迅速准确地锁定目的基因至关重要，其成败与所掌握的有关目的基因的背景知要，其成败与所掌握的有关目的基因的背景知识密切相关。目的基因的背景知识包括：识密切相关。目的基因的背景知识包括：目的基因的部分或全部碱基序列已知。目的基因的部分或全部碱基序列已知。目的基因编码产物的结构或功能已知。目的基因编码产物的结构或功能已知。目的基因与某些生物表型的相关性已知。目的基因与某些生物表型的相关性已知。(八八)用用噬菌体载体构建基因组文库的步骤噬菌体载体构建基因组文库的步骤准准备备载载体体DNA(如如置置换换型型噬噬菌菌体体载载体体)，用用适适当当的的限限制制性性内内切切核核酸酸酶酶消消化化并并分分离离得得到到载载体体的的左左右右两臂。两臂。纯纯化化真真核核细细胞胞高高分分子子质质量量DNA，并并用用适适当当的的限限制性内切核酸酶部分消化。制性内切核酸酶部分消化。分离适当大小的基因组分离适当大小的基因组DNA片段片段(20-24kb)。连接载体与外源连接载体与外源DNA。连接产物体外包装及感染。连接产物体外包装及感染。基因组文库的扩增。基因组文库的扩增。基因组文库基因组文库限制性内切酶限制性内切酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装三、三、cDNAcDNA文库构建文库构建真真核核生生物物基基因因组组大大，结结构构复复杂杂，含含有有大大量量的的非非编编码码区区、内内含含子子和和重重复复序序列列等等，直直接接利利用用基基因因文文库库很很难难分分离离得得到到目目的的基基因因。即即使使分分离离到到DNA片段，也要同片段，也要同cDNA序列进行比较。序列进行比较。mRNA是是基基因因转转录录加加工工后后的的产产物物，且且只只在在特特定定组组织织器器官官和和发发育育时时期期表表达达。因因此此，从从cDNA克克隆隆文文库库分分离离基基因因更更具具优优势势。此此外外，mRNA决决定定了了功功能能蛋蛋白白质质的的初初始始肽肽链链的的翻翻译译，可可以以用用来来研研究究蛋白质的功能。蛋白质的功能。(一一)cDNA文库的特征文库的特征从从cDNA文文库库获获得得的的是是已已经经过过剪剪接接、去去除除了了内内含含子子的的cDNA,它它不不含含真真核核基基因因的的间间隔隔序序列列及及调调控控区区,只只反反映映mRNA的分子结构，并不是真正意义上的基因。的分子结构，并不是真正意义上的基因。cDNA文库仅包含某种组织或细胞正在表达的基因。文库仅包含某种组织或细胞正在表达的基因。基基因因总总量量少少，显显然然比比基基因因组组DNA文文库库小小得得多多，很很容容易易从中筛选克隆得到细胞特异表达基因。从中筛选克隆得到细胞特异表达基因。cDNA文文库库是是有有时时效效性性的的，文文库库构构建建时时的的信信息息供供体体是是某某一一时时空空条条件件下下的的细细胞胞总总mRNA，它它是是在在转转录录水水平平上上反反映映该该生生物物在在某某一一特特定定发发育育时时期期，某某一一特特定定组组织织(或或器器官官)在在某某种种环环境境条条件件下下的的基基因因表表达达情情况况并并不不能能包包括括该该生生物物有有机机体体的的全全部部基基因因，不不同同物物种种、不不同同组组织织的的cDNA文库不同。文库不同。(二二)cDNA文库的用途文库的用途cDNA文文库库可可作作为为研研究究功功能能基基因因组组学学的的基基本本手手段段。cDNA便便于于克克隆隆和和大大量量表表达达,因因此此可可以以从从cDNA文文库库中中筛筛选到所需的目的基因选到所需的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。并直接用于该目的基因的表达。cDNA文文库库也也可可用用于于保保护护濒濒危危珍珍稀稀生生物物资资源源，提提供供构构建建分分子子标标记记连连锁锁图图谱谱的的所所用用探探针针，可可用用于于分分离离全全长长基基因因，进而开展基因功能的研究。进而开展基因功能的研究。cDNA在在研研究究具具体体某某类类特特定定细细胞胞中中基基因因组组的的表表达达状状态态及及表表达达基基因因的的功功能能鉴鉴定定方方面面具具有有特特殊殊的的优优势势，在在个个体体发发育育、细细胞胞分分化化、细细胞胞周周期期调调控控、细细胞胞衰衰老老和和死死亡亡调调控控等等生生命命现象的研究中具有广泛的应用价值。现象的研究中具有广泛的应用价值。(三三)cDNA文库构建的步骤文库构建的步骤细胞总细胞总RNA的提取和的提取和mRNA的分离的分离第一链第一链cDNA合成合成第二链第二链cDNA合成合成双链双链cDNA的分级分离的分级分离双链双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖宿主中繁殖重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定1、细胞总、细胞总RNA的提取和的提取和mRNA的分离的分离mRNA的来源的来源:选用选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等含量高的组织材料，或通过药物等方法提高方法提高mRNA的含量。的含量。mRNA的制备的制备:动物细胞或植物细胞动物细胞或植物细胞mRNA的制备的制备mRNA完整性的检测完整性的检测哺乳动物哺乳动物mRNA长度为长度为500-8000bp，大部分，大部分mRNA位于位于1.5-2.0kb之间。之间。mRNA的提取的提取全长全长mRNA具有一个具有一个polyA的的3末端，可以被用于末端，可以被用于mRNA的分离。的分离。可以用寡聚纤维素柱，选择性地吸附可以用寡聚纤维素柱，选择性地吸附mRNA。2、第一链、第一链cDNA的合成的合成oligo(dT)引导的引导的DNA合成法：合成法：利利用用真真核核mRNA分分子子所所具具有有的的poly(A)尾尾巴巴的的特特性性，加加入入12-20个个脱脱氧氧胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷组组成成的的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成短片段，由反转录酶合成cDNA第一链第一链 缺缺点点：因因为为逆逆转转录录酶酶无无法法到到达达mRNA分分子子的的5末末端端，必必须须从从3末末端端开开始始合合成成cDNA。对对于于大大分分子子量量的较长的的较长的mRNA分子无法达到分子无法达到5末端。末端。cDNAcDNA第一链的合成第一链的合成第一链的合成第一链的合成 随机引物引导的随机引物引导的cDNA合成法合成法 ：根根据据许许多多可可能能的的序序列列，合合成成出出6-10个个核核苷苷酸酸长长的的寡寡核核苷苷酸酸短短片片段段（混混合合物物），作作为为合合成成第第一一链链cDNA的的引引物物。在在应应用用这这种种混混合合引引物物的的情情况况下下，cDNA的的合合成成可可以以从从mRNA模模板板的的许许多多位位点点同同时时发发生生，而而不不仅仅仅仅从从3末末端端的的oligo(dT)引引物物一一处处开开始始。比比较较容容易易合合成成特特长长的的mRNA分分子子的的5端端序序列列随机引物随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建合成的方法不适合构建cDNA 文文库，一般用于克隆特定库，一般用于克隆特定 mRNA的的 5 末端，如末端，如 RT-PCR 和和 5-RACE。3 3、第二链、第二链cDNAcDNA的合成的合成cDNAcDNA第第二二链链的的合合成成就就是是将将上上一一步步形形成成的的mRNA-cDNAmRNA-cDNA杂杂合合双双链链变变成成互互补补双双链链cDNAcDNA的过程。的过程。cDNAcDNA第二链的合成的方法大致第二链的合成的方法大致4 4种：种：自自身身引引导导合合成成法法、置置换换合合成成法法、引引导导合合成法、引物衔接头合成法。成法、引物衔接头合成法。自身引导合成法：自身引导合成法：获获得得的的单单链链cDNA3cDNA3端端会会形形成成发发夹夹结结构构，以以此此作作为为第第二二链链合合成成的的引引物物，在在KlenowKlenow酶酶或或反反转转录录酶酶的作用下，合成的作用下，合成cDNAcDNA的第二链。的第二链。缺缺点点：S1S1核核酸酸酶酶切切割割cDNAcDNA的的发发夹夹状状结结构构时时，会会导导致致对对应应于于mRNA mRNA 55端端的的地地方方的的序序列列出出现现缺缺失失和和重重排排。S1S1核核酸酸酶酶的的纯纯度度不不够够时时，会会偶偶尔尔破破坏坏合成的双链合成的双链cDNAcDNA分子。分子。自身合成法：获得的双链自身合成法：获得的双链自身合成法：获得的双链自身合成法：获得的双链cDNAcDNA55端会有几对碱基缺失。端会有几对碱基缺失。端会有几对碱基缺失。端会有几对碱基缺失。置换合成法：置换合成法：cDNA 第第一一链链合合成成反反应应的的产产物物 cDNAmRNA不不经经变变性性直直接接与与 RNA酶酶 H 和和大大肠肠杆杆菌菌 DNA 聚聚合合酶酶混混合合，此此时时 RNA 酶酶 H 在在杂杂合合双双链链的的 mRNA 链链上上产产生生缺缺口口（内内切切作作用用）并并形形成成部部分分 cDNA 单单链链区区（外外切切作作用用）DNA 聚聚合合酶酶则则以以残残存存的的 mRNA作作为为引引物物合合成成 cDNA 第第二二链链，最最后后用用 T4DNA连连接接酶酶修修复复缺缺口口。用用这这种种方方法法获获得得的的 cDNA双双链链分分子子含含有有残残留留的的一一小小段段 RNA，但但这这并并不不影影响响后后续续的的克隆操作。克隆操作。优优点点：cDNA双双链链合合成成效效率率高高，操操作作简简捷捷无无需需对对第第一一链链合合成成产产物物进进行行额额外外的的变变性性处处理理，更更重重要要的的是是避免了避免了 cDNA 双链分子末端的缺损。双链分子末端的缺损。置换合成法置换合成法引引物物合合成成法法：在在第第一一链链合合成成完完毕毕后后，变变性性残残留留的的 mRNA，用用末末端端脱脱氧氧核核苷苷酰酰转转移移酶酶在在 cDNA 游游离离的的 3羟羟基基上上添添加加同同聚聚物物（dC）末末端端，然然后后将将之之与与人人工工合合成成的的 oligodG退退火火，形形成成引引物物结结构构，在在 Klenow 酶酶的的作作用用下下合合成成第二条第二条 cDNA 链。链。引导合成法：获得的双链引导合成法：获得的双链引导合成法：获得的双链引导合成法：获得的双链cDNA cDNA 能保留完整的能保留完整的能保留完整的能保留完整的55端序列端序列端序列端序列引物引物-衔接头法衔接头法4、双链、双链cDNA的分级分离的分级分离mRNA通过反转录形成通过反转录形成cDNA，在插入到克隆，在插入到克隆载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cDNA分子分离开来。分子分离开来。优点：优点：避免了分离过程中避免了分离过程中mRNA被污染的被污染的RNA酶降解酶降解增加了获得全长增加了获得全长cDNA克隆的概率。克隆的概率。获得更准确的分级分离效果（分子量）。获得更准确的分级分离效果（分子量）。5、双双链链cDNA克克隆隆进进质质粒粒或或噬噬菌菌体体载载体体并并导导入入宿宿主中繁殖主中繁殖cDNA末端的处理末端的处理由由于于大大片片段段的的平平末末端端连连接接效效率率非非常常低低，因因此此为为了了避避免免用用平平末末端端与与载载体体连连接接，对对双双链链cDNA的的末末端端进行加工是十分必要的。进行加工是十分必要的。方方法法：添添加加特特异异性性核核酸酸接接头头以以形形成成适适合合于于克克隆隆的的黏性末端。黏性末端。末末端端转转移移酶酶可可以以向向cDNA末末端端加加上上与与克克隆隆载载体体末端互补的尾部。末端互补的尾部。6 6、利用、利用、利用、利用PCRPCR技术构建技术构建技术构建技术构建cDNAcDNA文库文库文库文库能够从极其有限的起始材料中构建能够从极其有限的起始材料中构建能够从极其有限的起始材料中构建能够从极其有限的起始材料中构建cDNAcDNA文库。文库。文库。文库。以以以以总总总总RNARNA为为为为模模模模板板板板合合合合成成成成cDNAcDNA，无无无无需需需需mRNAmRNA的的的的纯纯纯纯化化化化，不不不不仅仅仅仅简简简简化化化化操操操操作作作作，而而而而且且且且避避避避免免免免了了了了低低低低丰丰丰丰度度度度信信信信息息息息分分分分子子子子的的的的丢丢丢丢失。失。失。失。能能能能够够够够提提提提高高高高cDNAcDNA文文文文库库库库的的的的完完完完整整整整性性性性，获获获获得得得得那那那那些些些些低低低低水水水水平平平平表表表表达达达达的的的的基基基基因因因因的的的的cDNAcDNA克克克克隆隆隆隆。此此此此法法法法对对对对植植植植物物物物基基基基因因因因功功功功能能能能的的的的研研研研究究究究，如如如如对对对对某某某某种种种种外外外外界界界界因因因因素素素素作作作作用用用用后后后后或或或或不不不不同同同同发发发发育育育育阶阶阶阶段基因表达变化的研究尤为适用。段基因表达变化的研究尤为适用。段基因表达变化的研究尤为适用。段基因表达变化的研究尤为适用。1 1、基因组文库、基因组文库的优点的优点基因组文库的优点：基因组文库的优点：基因组文库可以含有基因组的编码序列和间隔序基因组文库可以含有基因组的编码序列和间隔序 列，用于研究基因编码序列