枇杷PYL基因家族鉴定及表达分析.pdf
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1、 接收日期:2024-01-29 接受日期:2024-02-18 基金项目:福建省中青年教师教育科研项目(JAT210948)*通信作者。E-mail: 枇杷枇杷 PYL 基因家族鉴定及表达分析基因家族鉴定及表达分析 林秋香*,韩雨昕(湄洲湾职业技术学院,福建 莆田 351119)摘 要:脱落酸(ABA)是调节植物生长发育与非生物胁迫的重要激素之一,ABA 受体 Pyrabactin Resistance 1(PYR)-like(PYL)于信号通路的顶端发挥核心调控作用,但枇杷 Eriobotrya japonica 的 PYL 基因家族尚未鉴定。本研究通过生物信息学分析鉴定出枇杷 12 个
2、PYL 基因家族成员,枇杷 PYL 蛋白分子量为 10.4729.12 kDa,且主要定位于细胞质。枇杷PYL 基因家族成员分布在 8 条染色体上,进化树分析显示 PYL 基因家族包含三个亚家族,且枇杷 EjPYL1 与拟南芥AtPYL13 亲缘关系较近。枇杷 PYL 蛋白含有 16 个 motif,其中 motif3 为家族成员共有。枇杷 PYL 基因家族成员在物种内存在共线性,与拟南芥的物种间共线性有 2 对。顺式作用元件分析发现枇杷 PYL 基因启动子含有低温、干旱、光以及激素响应元件。枇杷幼果转录组分析表明,果肉和种子中 EjPYL6 和 EjPYL8 基因受低温诱导上调表达。该研究结
3、果将为枇杷 ABA 信号转导途径的解析和抗冻新品种培育提供理论依据。关键词:枇杷;PYL 基因家族;ABA;冻害胁迫 Doi:10.3969/j.issn.1009-7791.2024.01.001 中图分类号:S667.3 文献标识码:A 文章编号:1009-7791(2024)01-0001-11 Identification and Expression Analysis of PYL Gene Family in Eriobotrya japonica LIN Qiu-xiang*,HAN Yu-xin(Meizhouwan Vocational Technology College,
4、Putian 351119,Fujian China)Abstract:Abscisic acid(ABA)is one of the important hormones regulating plant growth and development,and abiotic stress.As an ABA receptor,PYL is located at the top of its signaling pathway and plays a core regulatory role.However,this gene family has not been identified an
5、d analyzed in detail in loquat.In this study,12 PYL genes were identified in loquat based on bioinformatics analysis.The molecular weight of the coding PYL protein ranged from 10.47 to 29.12 kDa,and most of them were localized in the cytoplasm.PYL family genes were distributed on 8 chromosomes.Phylo
6、genetic tree analysis showed that PYL gene family could be divided into three subfamilies and EjPYL1 was closely related to AtPYL13.PYL proteins in loquat were consisted of motif 1-6,and motif3 was the common domain.Genes of PYL family were collinearity in species loquat.There were 2 pairs of collin
7、earity between loquat and Arabidopsis thaliana.Cis-components in promoter of PYL genes were related to low temperature,drought,light and hormone response.RNA-seq of loquat young fruits indicated that EjPYL6 and EjPYL8 were both up-regulated by low temperature in fruit pulp and seeds.This study can p
8、rovide theoretical basis for further understanding ABA signal transduction pathway and breeding new varieties of loquat with frost resistance.Key words:Eriobotrya japonica;PYL gene family;ABA;freezing stress 2024,53(1):111.Subtropical Plant Science 第 53 卷 2枇杷 Eriobotrya japonica 为原产我国的一种南方特色果树,其栽培品种
9、由野生种驯化得来,均属于普通枇杷1。枇杷树体可耐12 以下低温而不受冻害;花可耐6 低温;幼果耐寒性较差,3 可导致低温冻害2。枇杷属大部分种类分布在北纬2030之间,极少数种分布在此范围之外3。此外,枇杷花芽秋季萌发、冬季开花、春季结果、夏季成熟,其生长发育历经四季,容易遭受夏季高温、干旱、水涝侵害和冬季低温冻害等多种非生物胁迫,从而造成果实产量和品质下降,严重时甚至绝收4。脱落酸(ABA)是重要的植物激素,不仅控制植物生长发育过程,还参与植物应对生物和非生物胁迫的反应,被称为植物的“胁迫激素”56。从低温胁迫开始到抗冻基因的表达是一个非常复杂的过程,其中,依赖于 ABA 信号途径的转录调控
10、具有重要作用7。当植物体受到低温胁迫时,外源 ABA 处理能够调节抗氧化酶活性、诱导冷信号传导和抗寒基因表达,从而提高植物的耐寒性89。吡喃菌素抗性基因家族(Pyrabactin resistance1(PYR)-like,PYL)作为ABA 受体,位于 ABA 信号转导通路的顶端10。PYL蛋白通过其内部的 ABA 结合腔与 ABA 分子直接结合形成复合物,导致 PYL 蛋白构象发生改变11,且每个PYL家族成员与ABA的结合能力存在差异12。PYL 蛋白与 ABA 结合形成的复合物可以抑制蛋白磷酸酶(Protein Phosphatase 2C,PP2C)活性,从而解除 PP2C 对蔗糖非
11、发酵-1-相关蛋白激酶 2(Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2,SnRK2)的抑制,导致正调控因子 SnRK2 的激活和释放1314。SnRK2 自身磷酸化后,再经过下游转录因子或膜蛋白等作用因子的磷酸化,开启 ABA 信号应答。调控 ABA 信号转导的各个信号因子相互联系,从而形成一条完整的 ABA 信号通路15。过表达PYL 家族基因成员,能够提高转基因作物对 ABA的敏感性和抗寒性,促进果实成熟16。拟南芥Arabidopsis thaliana 的 AtPYL4 过表达增强了拟南芥耐旱性17,AtPYL8 与 AtPYL9
12、 在拟南芥侧根生长中起重要作用18;玉米 Zea mays 的 ZmPYL8、ZmPYL9和 ZmPYL12 等基因过表达可以增强玉米耐寒性19;水稻Oryza sativa的OsPYL5过表达可以增强水稻抗旱性和抗盐性20。PYL 还与细胞内其他蛋白相互作用,参与植物发育和胁迫应答过程21。本研究应用生物信息学技术鉴定枇杷PYL基因家族成员,分析其基本特征、结构特征以及进化关系,进一步分析其在枇杷幼果响应冻害胁迫中的表达模式,筛选抗冻 PYL 基因,为枇杷 ABA 信号转导途径的解析和抗冻新品种培育奠定理论基础。1 材料与方法 1.1 数据获取 枇杷全基因组数据下载于 https:/gb.o
13、rg/cnsa,拟南芥 PYL 基因家族蛋白下载于 TAIR数据库(https:/www.arabidopsis.org/),枇杷幼果低温胁迫 RNA-seq 来源于本实验室已发表数据22。1.2 枇杷 PYL 基因家族分析 1.2.1 枇杷枇杷 PYL 基因家族成员鉴定基因家族成员鉴定 将 TAIR 网站下载的拟南芥 PYL 基因家族的蛋白质序列文件整理成 fa 文件。通过 TBtools 软件,应用BLASTp工具将获得的拟南芥PYL基因家族的蛋白质序列比对枇杷全基因组,Outfmt 选择 Table,其余参数采用默认设置。获取相似度50%的枇杷PYL基因,再去冗余后得到枇杷PYL基因家族
14、成员。通过 TBtools(v0.669)提取候选 PYL 基因的蛋白序列,使用 Pfam 网站(http:/pfam.xfam.org)验证蛋白质序列,E-value 值设置为 0.01,根据是否存在Polyketide_cyc2 结构域(PF10604),判断是否含有家族特征结构域,进而确定枇杷PYL各家族基因成员。1.2.2 枇杷枇杷 PYL 家族基因的基本特性预测家族基因的基本特性预测 使用在线软件 ProtParam(http:/web.expasy.org/protparam/)分析鉴定枇杷 PYL 家族基因编码蛋白的理化性质,同时使用 WoLF PSORT(https:/wolf
15、psort.hgc.jp/)和 Plant-mPLoc(http:/ PYL 家族蛋白的亚细胞定位,明确枇杷 PYL 家族基因的基本特性。1.2.3 染色体定位分析染色体定位分析 从基因注释文件中获取基因在染色体上的位置信息与染色体的长度信息,再通过 MG2C 网站(http:/mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)可视化,完成枇杷PYL 基因家族在染色体上的定位。第 1 期 林秋香等:枇杷 PYL 基因家族鉴定及表达分析 31.2.4 系统发育分析系统发育分析 将枇杷 PYL 蛋白质序列和拟南芥 PYL 基因家族进行混合建树,使用 MEGA-X 软件的 Clustal W进行蛋白质
16、多序列比对。采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ),使用 Booststrap method 进行显著性检验,重复抽样指数选择1000 次,线程数设置为15(其余参数采用默认参数设置)。将绘制好的系统发育树通过 Evolview 网站(https:/evolgenius.info/evolview-v2/mytrees/1/1)进行可视化。1.2.5 基因结构分析与基因结构分析与 Motif 分析分析 将枇杷 PYL 蛋白序列文件于 MEGA 中进行多序列比对,用 MEG 文件构建进化树。利用 MEME SUITE在线工具(http:/meme-suite.org/tools/m
17、eme)分析 PYL 家族蛋白的保守基序,设置限值为 10,其余设置为默认值。从全基因组 gff 注释文件中提取 PYL基因。采用 TBtools 软件中的 Advanced 绘制进化树、motif、基因结构示意图。1.2.6 基因共线性分析基因共线性分析 通过 TBtools 的 Advanced Circos 进行枇杷基因组物种内共线性分析,并与拟南芥基因组进行物种间共线性分析。利用TBtools绘制枇杷与拟南芥PYL基因家族成员的共线性图谱。1.2.7 基因启动子元件分析基因启动子元件分析 从枇杷基因组中提取 PYL 家族成员上游 2000 bp 序列,利用 Plant CARE 数据(
18、http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测启动子顺式作用元件,利用 TBtools 对其结果可视化。1.3 枇杷 PYL 表达模式分析 将早钟 6 号枇杷 2 年生花后 60 d 的嫁接苗放于人工气候箱培养,温度分别设置为 25、1 和3,处理时间分别为 2 h、4 h 和 6 h,每处理设 3 个生物学重复,每重复 3 株,植株处理后移至室温平衡 12 h。取下幼果,分别将果肉和种子于液氮速冻后保存于80 冰箱。转录组测序由武汉迈特维尔生物科技有限公司完成。获取 PYL 基因家族成员在不同温度(25、1、3)、不
19、同时间(2 h、4 h、6 h)条件下于果肉及种子中的表达量数据。删除表达量均值低于 1 的基因成员后,对数据进行分类及平均值处理。当 FPKM 均值50 时为高表达,5FPKM 均值50 为中等表达,1FPKM 均值5为低表达,FPKM 均值1 为不表达。利用 TBtools软件中的HeatMap绘制筛选出的枇杷PYL基因表达热图,使用 Scale 函数做 01 标准化处理并聚类,以表达量值高于 1.5 倍的基因作为差异表达基因。2 结果与分析 2.1 枇杷 PYL 基因家族成员鉴定 通过 BLAST 分析获得枇杷 PYL 基因 12 个,分别 为 Ej00093191、Ej00022224
20、、Ej00050698、Ej00081565、Ej00058960、Ej00006971、Ej00071861、Ej00093052、Ej00032680、Ej00039656、Ej00073098、Ej00035824。使用 Pfam 网站(http:/pfam.sanger.ac.uk/search)绘制枇杷 PYL 基因家族结构域图,枇杷PYL 基因家族成员均有 Polyketide_cyc2 结构域(图 1)。此外,分别有 5 个枇杷 PYL 家族成员具有Polyketide_cyc 结构域,有 4 个枇杷 PYL 家族成员具有 Bet_v_1 结构域(图 1)。2.2 枇杷 PYL
21、基因家族成员理化性质 枇杷 PYL 基因家族的理化性质通过 Expasy ProtParam 在线获取,PYL 基因家族成员氨基酸长度为 94262 aa,平均长度为 200 aa(表 1)。EjPYL1蛋白长度最少,为 94 aa,与该基因家族的其他成员相差较大。蛋白质分子量为 10.4729.12 kDa,平均分子质量 22.04 kDa;理论等电点 pI 4.939.10,其中有 9 个基因的等电点在酸性范围,1 个基因在中性范围,2 个基因在碱性范围,酸性基因占 75%,推测 PYL 基因家族成员富含酸性基因(表 1)。枇杷PYL 蛋白具有不同的蛋白质分子量和不同的等电点,它们可能在不
22、同的环境中发挥相应功能。通过 PSORT(http:/wolfpsort.hgc.jp/)与 mPLoc(http:/ PYL 基因亚细胞定位(表 1)。WoLF PSORT 结果显示,大部分枇杷 PYL 家族成员定位于细胞质与叶绿体;Plant-mPLoc 结果显示,枇杷 PYL基因家族中有 8 个基因被定位在细胞质上,有 3 个基因表达于细胞核,有 3 个定位至叶绿体,其中EjPYL3 和 EjPYL12 共定位于细胞核和叶绿体。亚细胞定位分析预测显示枇杷 PYL 基因主要表达于细胞 第 53 卷 4 图 1 枇杷 PYL 基因结构域 Fig.1 PYL genes domain map
23、of loquat 表 1 枇杷 PYL 基因基本特性预测 Table 1 Prediction of basic characteristics of PYL genes in loquat 基因名 基因号 氨基酸 长度/aa 分子量(MW)/Da 理论等 电点(pI)Start position End position WoLF PSORT Plant-mPLocEjPYL1 Ej00093191 94 10476.80 5.41 6297665 6297949 cyto,nucl,extr,golg nucl EjPYL2 Ej00022224 184 20782.59 6.30 23
24、445601 23448500cyto,extr,chlo,nucl,cysk,golg chlo EjPYL3 Ej00050698 193 21507.30 5.97 35947126 35949923nucl,extr,cyto,vacu,cysk chlo,nucl EjPYL4 Ej00081565 196 21688.52 5.51 38882484 38883074cysk,extr,nucl,cyto cyto EjPYL5 Ej00058960 201 22066.67 4.93 3315814 3316419 nucl,cyto,extr cyto EjPYL6 Ej000
25、06971 201 22091.95 6.13 37537324 37539649cyto,nucl,extr,cysk cyto EjPYL7 Ej00071861 207 22732.64 6.44 31291285 31291908chlo,nucl,cyto,extr cyto EjPYL8 Ej00093052 207 22761.59 6.44 33019530 33020153chlo,nucl,pero cyto EjPYL9 Ej00032680 206 22812.36 5.35 32594635 32595255cyto,nucl,chlo,extr,cysk,golg
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