第四章酶分子修饰.pptx

Contents of chapter 41、什么是酶分子修饰2、酶分子修饰的基本要求和条件3、酶分子的修饰方法4、酶修饰后的性质变化GoGoGoGo5、酶的定向进化Go4.1 4.1 什么是酶分子修饰？什么是酶分子修饰？o通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。酶分子修饰的意义o提高酶的活力活力 activityactivityo增强酶的稳定性稳定性 stabilitystabilityo降低或消除酶的抗原性抗原性 immunological propertyimmunological propertyo研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structurestructure 回本章目录4.2 酶分子修饰的基本要求和条件酶分子修饰的基本要求和条件 o对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。n（1 1）酶的稳定性酶的稳定性o热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pHpH、抑制剂等。、抑制剂等。n（2 2）酶活性中心的状况酶活性中心的状况 o活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。亚基数等。酶分子修饰的条件酶分子修饰的条件o修饰反应尽可能在修饰反应尽可能在酶稳定条件酶稳定条件下进行，并尽量下进行，并尽量不破坏酶不破坏酶活性功能的必需基团活性功能的必需基团，使，使修饰率高修饰率高，同时酶的，同时酶的活力回收活力回收高高。n（1 1）pHpH与离子强度与离子强度 opHpH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。于它们的解离状态不同，反应性能也不同。n（2 2）修饰反应的温度与时间修饰反应的温度与时间 o严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。一性的修饰反应。n（3 3）反应体系中酶与修饰剂的比例反应体系中酶与修饰剂的比例 回本章目录4.3 4.3 酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法 o金属离子置换修饰金属离子置换修饰,o大分子结合修饰大分子结合修饰(共价共价/非共价非共价)o侧链基团修饰侧链基团修饰o肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰o氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰o酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰(1)(1)酶的金属离子置换修饰酶的金属离子置换修饰o把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。o-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)o若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。金属离子置换修饰的过程金属离子置换修饰的过程 p a.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。p b.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。p c.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。p 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。p 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。(2)(2)酶的大分子修饰酶的大分子修饰o使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。o一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。o另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。非共价修饰非共价修饰o用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。o例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。o每分子核糖核酸酶与6.56.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.252.25倍；o每分子胰凝乳蛋白酶与1111分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.15.1倍 共价修饰共价修饰大分子修饰大分子修饰(共价共价)的过程的过程o修饰剂的选择修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。o修饰剂的活化修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。o修饰修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。o分离分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。o聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。它被广泛用于酶的修饰。酶 半衰期相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇聚乙二醇-SOD-SOD 35 h35 h 350350(3)(3)酶分子的侧链基团修饰酶分子的侧链基团修饰o采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。o可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。o酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧氨基、羧氨基、羧氨基、羧基、巯基、胍基、酚基基、巯基、胍基、酚基基、巯基、胍基、酚基基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。催化活性催化活性/非催化活性基团的修饰非催化活性基团的修饰o对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。殊底物的束缚能力。o经常被修饰的残基是：经常被修饰的残基是：n亲核的亲核的SerSer、CysCys、MetMet、ThrThr、LysLys、HisHisn亲电的亲电的TyrTyr、TrpTrpo对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。基酸的取代。常见基团的化学修饰反应：羧基常见基团的化学修饰反应：羧基常见基团的化学修饰反应：羧基常见基团的化学修饰反应：羧基常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：咪唑基常见基团的化学修饰反应：咪唑基常见基团的化学修饰反应：咪唑基常见基团的化学修饰反应：咪唑基常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基(4)(4)酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰)o利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。o酶蛋白主链修饰主要是靠酶切酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。酶原激活法。a a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 b b、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogentrypsinogen）的激活）的激活 c c、胰凝乳蛋白酶原（、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogenchymotrypsinogen）的激活）的激活 o氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。o现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesissite directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Protein EngineeringEngineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。(5)(5)氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰酶分子的定点突变酶分子的定点突变1 1、基因序列分析、基因序列分析2 2、蛋白质结构分析、蛋白质结构分析3 3、酶活性中心分析、酶活性中心分析4 4、引物设计进行基因定点突变、引物设计进行基因定点突变5 5、酶基因克隆表达、酶基因克隆表达6 6、变异特性分析、变异特性分析(6)(6)酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰 o通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。o特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。回本章目录4.4 4.4 酶修饰后的性质变化酶修饰后的性质变化o热稳定性热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。：一般来说，热稳定性有较大的提高。o抗原性抗原性：比较公认的是：比较公认的是PEGPEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。比较明显。o各类失活因子的抵抗力各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。抵抗能力，从而提高其稳定性。o半衰期半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。o最适最适pHpH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pHpH发生了变化，这种变发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pHpH更接近于生理环境，更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。在临床应用上有较大意义。oKmKm的变化的变化：大多数酶经修饰后，：大多数酶经修饰后，VmVm没有明显变化，但有些酶经修饰没有明显变化，但有些酶经修饰后，后，KmKm值变大。值变大。回本章目录4.5 4.5 酶的定向进化酶的定向进化o酶分子的酶分子的合理设计合理设计(rational design)(rational design)o酶分子的酶分子的定向进化定向进化(directed evolution)(directed evolution)酶的合理设计酶的合理设计体外定向进化的意义体外定向进化的意义体外定向进化的意义体外定向进化的意义o理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。o所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。定向选择出所需性质的突变酶。o酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。定向进化的原理定向进化的原理o在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3-5校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。o定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体”。oo定向进化定向进化定向进化定向进化=随机突变随机突变随机突变随机突变+选择选择选择选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的DNADNADNADNA改组和外显子改组改组和外显子改组改组和外显子改组改组和外显子改组DNADNADNADNA改组（改组（改组（改组（DNA shufflingDNA shufflingDNA shufflingDNA shuffling）又称有性PCR(sexual PCR)，原理。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组,不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。外显子改组（外显子改组（外显子改组（外显子改组（exon shufflingexon shufflingexon shufflingexon shuffling）类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。DNADNADNADNA改组原理改组原理改组原理改组原理定向进化的选择策略定向进化的选择策略定向进化的选择策略定向进化的选择策略1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的选择特定方向的选择特定方向的选择特定方向的突变限定了进化趋势突变限定了进化趋势突变限定了进化趋势突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。2、通常,筛选方法必须灵敏筛选方法必须灵敏筛选方法必须灵敏筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关至少与目的性质相关至少与目的性质相关至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。高通量的筛选体系酶性质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCR-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN稳定性 盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组 胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组酶的体外定向进化应用实例酶的体外定向进化应用实例酶的体外定向进化应用实例酶的体外定向进化应用实例回本章目录