细胞融合概述.pptx
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1、细胞融合概述细胞融合概述细胞融合(细胞融合(cellfusion),又称体细胞杂交(somatic hybridiazation),是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。一、细胞融合的定义一、细胞融合的定义uMuller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。uVirchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。uLuginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。uLange于1875年第一个观察到脊椎动物(蛙类)的血液细胞发生融合的过程。uCienkawski(1876)、Buck(1
2、877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。u1958年日本学者冈田(Okada)发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。u1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇(PEG)化学融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。u20世纪80年代出现了电融合技术。二、细胞融合研究进展二、细胞融合研究进展生物种类生物种类生物种类生物种类细胞来源细胞来源细胞来源细胞来源成功年代成功年代成功年代成功年代烟草两个种间烟草两个种间苷蓝苷蓝青菜青菜大豆大豆马唐草马唐草矮牵牛矮牵牛龙面花龙面花大麦大麦花
3、生花生大麦大麦大豆大豆小麦小麦矮牵牛矮牵牛油菜油菜大豆大豆玉米玉米大豆大豆大豆大豆野豌豆野豌豆大麦大麦蚕豆蚕豆大豆大豆草香木犀草香木犀酵母菌酵母菌鸡鸡大豆大豆烟草烟草大豆大豆秋水仙秋水仙人人胡萝卜胡萝卜番茄番茄马铃薯马铃薯人人小鼠小鼠叶叶叶叶叶叶根根愈伤组织愈伤组织叶叶叶叶花瓣花瓣种子种子种子种子叶叶悬浮细胞悬浮细胞叶叶花瓣花瓣叶叶悬浮细胞悬浮细胞叶叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶根根悬浮细胞悬浮细胞叶叶原生质体原生质体血红细胞血红细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶悬浮细胞悬浮细胞叶叶腹水癌细胞腹水癌细胞原生质体原生质体叶叶根尖根尖纤维肉瘤细胞纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞畸胎瘤细胞197
4、219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的右瓶为地面融合的细胞,左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞细胞,左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞 动物细胞融合实验使用的小白鼠 三、动植物细胞的融合过程三、动植物细胞的融合过程植物细胞融合过程植物细胞融合过程
5、人造小鼠培育过程示意图人造小鼠培育过程示意图四、细胞融合的意义四、细胞融合的意义u理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。u融合过程融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,为远缘物种间,为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。的遗传物质交换提供了有效途径。u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的
6、分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组,从而产生新亦可发生重组,从而产生新 的核外遗传系统。的核外遗传系统。u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。细胞融合的基本原理细胞融合的基本原理显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 细胞融合的常用方法细胞融合的常用方法一、仙台病毒法一、仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶
7、段:仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段:两种细胞在一起培养,加入病毒,在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚;在37中,病毒与细胞膜发生反应,细胞膜受到破环,此时需 要Ca2+和Mg2+,最适PH为8.0一8.2;细胞膜连接部穿通,周边连接部修复,此时需Ca2+和ATP;融合成巨大细胞,仍需ATP。病毒促使细胞融合的主要步骤如下:病毒促使细胞融合的主要步骤如下:1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近;2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透,胞质互相渗透;3.两个原生质体的细胞核互相融合,两个细胞融为一体;4.进入正常的细胞分裂途径,分裂成含有两种染色体的杂种
8、细胞。用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 u 优点是易得,用法简单,融合效果稳定。u聚乙二醇(PEG)结构为:HOH2C(CH20CH2)nCH2OH,分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。uPEG浓度以W/W;如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合(假定1ml培养液为1g重),即成50PEG溶液。uPEG经高压灭菌后,与温热的Engle氏液混合。u通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好,50PEG溶液能产生最多杂交细胞。uPEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。二、聚乙二醇(二、聚乙二醇(PEG)法)法聚乙二醇(聚乙二醇(
9、PEG)法细胞融合过程)法细胞融合过程PEG的作用机理的作用机理:Kao等认为,由于等认为,由于PEG分子分子具有轻微的负极性,故可以与具有正极性基团具有轻微的负极性,故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键,从而键,从而在在质膜之间形成分子桥,其结果是使细胞质在在质膜之间形成分子桥,其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合;另外,膜发生粘连进而促使质膜的融合;另外,PEG能增加类脂膜的流动性,也使细胞的核、细胞能增加类脂膜的流动性,也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。器发生融合成为可能。PEG诱导融合的特点诱导融合的特点:其优点是融合成本低
10、,勿需特殊其优点是融合成本低,勿需特殊设备;融合子产生的异核率较高;融合过程不受物种限设备;融合子产生的异核率较高;融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐,制。其缺点是融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害。可能对细胞有毒害。聚乙二醇(聚乙二醇(PEG)法)法细胞融合步骤细胞融合步骤(1)将两种不同亲本细胞各5l06混匀;(2)离心沉淀,吸去上清液;(3)加1ml 50PEG溶液,用吸管吹打,使之与细胞接触1分钟;(4)加9ml 培养液,离心沉淀,吸去上清液;(5)加5ml 培养液,分别接种5个直径60mm平皿,每个平皿加培养 液至 5ml,37的CO2培养箱中培养。(6)624小时后,换成
11、选择培养液筛选杂交细胞。三、电融合法三、电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术,在直流电脉冲的诱导下,细胞膜表面的氧化还原电位发生改变,使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭和成完整的膜,形成融合体。电融合法的优点:电融合法的优点:u融合率高、重复性强、对细胞伤害小;u装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程;u免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。电融合的基本过程:电融合的基本过程:细胞膜的接触:细胞膜的接触:当原生质体置于电导率很低的溶液中时,电场通当原生质体置于电导率很低的溶液中时,电场通电后,电流即通过原生质体而不是通过溶液,其结果是原
12、生质体在电后,电流即通过原生质体而不是通过溶液,其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子,从而使原生质体紧密接触排列成串;电场作用下极化而产生偶极子,从而使原生质体紧密接触排列成串;膜的击穿:膜的击穿:原生质体成串排列后,立即给予高频直流脉冲就可以原生质体成串排列后,立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿,从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。使原生质膜击穿,从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。电融合诱导法原理示意图电融合诱导法原理示意图杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选n原理:两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞,筛选的目的是获得优良的杂种细胞。n1)亲
13、本 n2)同核体:同源原生质体的融合体n3)异核体:非同源的原生质体的融合体n4)多核体:含有双亲不同比例核物质的融合体n5)异胞质体:具有不同胞质来源的杂合细胞。n6)核质体:有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体u基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选u具有所需性状杂种细胞的筛选常用的杂种细胞筛选方法常用的杂种细胞筛选方法植物细胞筛选方式1)遗传互补筛选法:利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因,纠正另一亲本的缺陷,令杂种细胞表现正常。n 如亲本1:叶绿体缺陷型 亲本2:光致死型 两亲本在光照下一种死亡,另一种呈白
14、色,融合细胞长成植株呈绿色,并能成长n2)抗性互补筛选法:利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。n如:n亲本1:对放线菌素D抗性,但在MS培养基上不能超过50个世代n亲本2:对放线菌素D很敏感,但能在MS上生长n杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长,而亲本和其它细胞死亡3)利用物理特性筛选法:根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。亲本1:用异硫氰酸荧光素染色原生质体 亲本2:叶肉细胞原生质体 在荧光显微镜下,亲本1为红色,亲本2为绿色,杂种细胞可以区分n4)利用生长特性筛选法:利用原生质体对培养基成分要求与
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