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细胞转染技术.pptx
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1、细胞转染技术汇报人:宋晓萍2015.5.9目录目录基本原理基本原理1质粒提取扩增质粒提取扩增234常见问题及解决方案常见问题及解决方案5影响转染实验的因素影响转染实验的因素转染方法转染方法基本原理基本原理1将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。细胞转染细胞转染研究内容:研究内容:研究和控制真核细胞基因功能应应用:用:基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验常规转染技术常规转染技术瞬时转染外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞
2、能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。稳定转染外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,半乳糖苷酶等来帮助检测。脂质体介导转染脂质体介导转染脂质体转染的原理基于电荷吸引原理,先形成脂质体-DNA复合物,散布在细胞周围,然后通过细胞的内吞作用
3、,将目的基因导入细胞内。1.promega公司Promega转染试剂产品适合于人HeLa,HepG2,293,K562,Jurkat;猴COS-7,CV-1;小鼠NIH3T3;仓鼠BHK,CHO;大鼠PC12;昆虫S19等等细胞系的RNAi转染。2.Invitrogen公司Lipofetamine2000,适合于Hela,BHK,HEK,COS-7,PC12,NIH3T3等各种常用细胞系的RNAi转染。3.转染FAQs:转染试剂的选择转染试剂的选择脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍,所以,脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。悬浮细胞是用的电穿孔法。质粒提取扩增质
4、粒提取扩增2质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA重组的常用载体。将细菌质粒转化到大肠杆菌中,然后从大肠杆菌中收获大量质粒的过程。将质粒DNA导入细菌的过程1、质粒的转化感受态细菌细胞在CaCl2低渗溶液中膨胀为球状(感受态细菌的制备,略)。质粒DNA与CaCl2形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物黏附于细菌表面,经42短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中,外源基因得到表达。BL21(DE3)一般用于外源基因的原核表达,DH5a,TG1和HB2151一般用于重组质粒的克隆和扩增TG1长得慢,菌落较小,转化效率高
5、,用于普通的克隆测序,BL21(DE3)长的快,菌落较大,转化效率低点,主要用于原核表达。感受态细菌细胞感受态细菌细胞特点特点用途用途TG1长得慢,菌落较小,转化效率高,用于普通的克隆测序DH5aE.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的半乳糖苷酶氨基端实现互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。常用于分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。BL21(DE3)该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于 噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。长的快,菌落较大,转化效率低点。一般用于外源基因
6、的原核表达JM109该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZM15进行互补,从而显示半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。I.细菌铺板:加入抗生素(终浓度是50ug/ml-100ug/ml)II.挑选菌落:从LB培养基上挑选菌落备用III.细菌培养:37摄氏度培养箱中以180rpm摇动1214h,使大肠杆菌繁殖IV.碱裂解抽提:采用细胞裂解的方式,从含目标质粒的大肠杆菌菌液中将质粒提取出来2、质粒的提取扩增质粒的转化具体方法省略NOTE:I.不同的感受态细菌转化
7、效率不同,选择合适的E.coliII.1ng的cccDNA就可使50ul的感受态细胞饱和,DNA量过多会降低转化效率。III.转化时为提高转化效率,质粒加入E.coli培养1h后可离心弃上清后用剩余的菌液涂布。在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的原因,可能使质粒DNA链发生断裂。所以,多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒:15,000bp10,000bp7,500bp5,000bp ErbB2 ErbB2 ErbB2共价闭合环状DNA(超螺旋):质粒的两条链没有断裂;开环DNA:质粒的一条链断裂;松弛的环状分子;线形DNA:质粒的两条链均断裂;线性分子Q1:原先测序鉴定没有问题的细菌
8、,:原先测序鉴定没有问题的细菌,37摇菌后发现质粒大小或序列出现异常摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?这种情况出现的几率较小,常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法:1.降低培养温度,在2025下培养,或室温培养可明显减少发生概率。2.使用一些特殊菌株,如Sure菌株,它缺失了一些重组酶,如rec类等,使得质粒复制更加稳定。3.质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液中的NaOH浓度过高造成的常见问题及解决方案常见问题及解决方案Q2:未提出质粒或质粒得率较低,如何解决:未提出质粒或质粒得率较低,如何解决?1.大肠杆菌老化,细菌发生溶菌,可减少培养时间或者试试平板培养,2.质粒拷贝数低,质粒
9、抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的,刚活化的菌比负80保存菌种所培养出来的菌液状态好,保存久的菌株可能会造成质粒浓度低,质粒丢失等不明原因。3.菌体中无质粒,质粒丢失。每次接种时应接种单菌落。另外,检查抗生素使用浓度是否正确。判断生长的菌液是否正常,可以用肉眼观察,在光线明亮处摇荡新鲜培养液,如果菌液呈漂絮状,情况很好。如果呈泥水状,即看不到絮状,则可能提不出好的质粒,或者没有质粒。4.碱裂解不充分,菌液不宜生长太浓,摇床速度不宜过高。5.吸附柱过载:6.质粒未全部溶解(尤其质粒较大时):洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。7.乙醇残留:漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,再加入洗
10、脱缓冲液。8.洗脱液加入位置不正确:洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。9.洗脱液不合适:DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,如洗脱缓冲液或水。洗脱效率还取决于pH值,最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内,如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60后使用,有利于提高洗脱效率。10.洗脱体积太小:随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。11.洗脱时间过短:洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。3转染方法转染方法瞬时转染瞬时转染1 稳定转染稳定转染23逆转录病毒转
11、染逆转录病毒转染细胞培养用品细胞培养用品表面积(表面积(mm2/孔)孔)细胞密度细胞密度培养基(培养基(l/孔)孔)96孔板501.5104-5.0104100l48孔板1003.0104-1.0105200l24孔板2008.0104-2.0105500l12孔板4011.6105-4.01051.0ml6孔板9623.0105-8.01052.0ml35mm9623.0105-8.01052.0ml60mm28271.0106-2.51066.0ml转染前细胞培养转染前细胞培养细胞培养用品细胞培养用品siRNA/DNA培养基终体积培养基终体积Lipo2000(siRNA/DNA)96孔板5
12、pmol/0.2g100l0.25l/0.5l24孔板20pmol/0.8g500l1l/2l12孔板40pmol/1.6g1.0ml2l/4l6孔板100pmol/4.0g2.0ml5l/10l35mm100pmol/4.0g2.0ml5l/10l60mm600pmol/8.0g5.0ml10l/20l推荐的推荐的DNA:Lipo2000=1:0.5-1:5(ug:ul)siRNA:Lipo2000=1:0.01-1:0.1(pmol:ul)瞬时转染瞬时转染11.转染前一天铺板:5.0-8.0104细胞接种在24孔板上,0.5ml正常培养基。2.24h后的细胞融合达到70%-90%的密度。3
13、.转染:(1)50ul无血清培养基(Opti-MEM)+20pmolsiRNA(或0.8ugDNA),柔和混匀,室温孵育5min(2)50ul无血清培养基+1ullipo2000(DNA+2ullipo2000)柔和混匀,室温孵育5min。(3)将DNA加入Lipo2000中,轻柔混匀,室温孵育20min4.将24孔板中的正常培养基换为无血清的培养基(Opti-MEM)1.9ml。5.将100ulsiRNA/Lipo2000(DNA/Lipo2000)复合物混匀逐滴加入孔中,轻轻摇匀。6.4-6h后,换培养基(全培),48-72小时监测转染水平。7.转染效率:绿色荧光蛋白看荧光mRNA水平,4
14、8h后收样品,做PCR蛋白水平,72h后收蛋白,做WB。稳定转染稳定转染21.转染前一天铺板:5.0-8.0104细胞接种在24孔板上,0.5ml正常培养基。2.24h后的细胞融合达到70%-90%的密度。3.转染:(1)50ul无血清培养基(Opti-MEM)+20pmolsiRNA(或0.8ugDNA),柔和混匀,室温孵育5min(2)50ul无血清培养基+1ullipo2000(DNA+2ullipo2000)柔和混匀,室温孵育5min。(3)将DNA加入Lipo2000中,轻柔混匀,室温孵育20min4.将24孔板中的正常培养基换为无血清的培养基(Opti-MEM)1.9ml。5.将1
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