pet系统原核表达详细总结.pptx
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1、PETPET原核表达系统原核表达系统pETpET系统是有史以来在系统是有史以来在E.coliE.coli中克隆表达重组蛋中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pETpET质粒载体上。受噬菌体质粒载体上。受噬菌体T7T7强转录及翻译信强转录及翻译信号控制,表达由宿主细胞提供的号控制,表达由宿主细胞提供的T7RNAT7RNA聚合酶聚合酶诱导。诱导。T7RNAT7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性:聚合酶机制十分有效并具选择性:充分诱导时,几乎所有的细胞资源都用于表达充分诱导时,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。目的蛋白。不依赖连接反应的克隆
2、方法(不依赖连接反应的克隆方法(LIC)用用LICLIC法制备的法制备的pETpET载体有不互补的单链粘端,与目的插载体有不互补的单链粘端,与目的插入片段上相应的粘端互补。扩增目的插入片段的引物入片段上相应的粘端互补。扩增目的插入片段的引物5 5,端端序列要与序列要与LICLIC载体互补。载体互补。T4DNAT4DNA聚合酶的聚合酶的3 3,-5 -5,外切酶活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由外切酶活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由制备好的插入片段和载体互相形成退化产物,这种方法十制备好的插入片段和载体互相形成退化产物,这种方法十分快速高效且为定向克隆。分快速高效且为定向克
3、隆。pETpET载体上编码的氨基酸序列载体上编码的氨基酸序列可通过肠激酶或可通过肠激酶或X X因子去掉。因子去掉。Function of T7 PolymeraseThe 35 exonuclease activity of T4 DNA polymerase removes nucleotides until it encounters a residue corresponding to the single dNTPpresent in the reaction mix.At this point the 53 polymerase activity of the enzyme coun
4、teractsthe exonuclease activity to effectively prevent further excision.pET载体pET载体最初是由Studier及其同事构建。(Studier and Moffatt,1986;Rosenberg et al.,1987;Studier et al.,1990).包括两种载体转录载体(用于表达本身含有核糖体结合位点和起始密码子目的基因)和翻译载体(载体上带有核糖体结合位点)。一般来说,转录载体用于表达来自原核的基因,而翻译载体表达真核基因。抗生素抗性pETpET载体常用的两种筛选标记是载体常用的两种筛选标记是Ampr+A
5、mpr+和和Knar+Knar+因为内酰胺酶的消化和因为内酰胺酶的消化和PHPH的降低,的降低,Ampr+Ampr+的选择的选择性易于丢失。某种情况下使用性易于丢失。某种情况下使用Knar+Knar+更为有利。更为有利。Ampr+Ampr+和和Knar+Knar+的另一个不同是两种基因的转录的另一个不同是两种基因的转录方向不同方向不同 。Ampr+Ampr+位于位于T7T7启动子下游,与其方向启动子下游,与其方向相同。除了相同。除了pET5pET5系列,系列,T7T7转录终止序列位于内酰转录终止序列位于内酰胺酶基因前面,但是这个终止序列只有胺酶基因前面,但是这个终止序列只有70%70%的有的有
6、效性。因此,效性。因此,T7T7聚合酶能够通读,导致内酰胺酶聚合酶能够通读,导致内酰胺酶的积累。相反的积累。相反Knar+Knar+的转录方向与的转录方向与T7T7启动子方向启动子方向相反,诱导时并没有相反,诱导时并没有Knar+Knar+基因的增加。基因的增加。用于克隆的宿主菌用于克隆的宿主菌通常是Novablue,JM109以及DH5a。这些菌株是rec-end-型,转化效率高,且质粒产量也高,适合用于保存带有克隆目的基因的PET载体。用于表达的宿主菌BL21(DE3)基因型:F ompT hsdSB(rB mB)gal dcm(DE3)无抗性重组质粒转化到带有T7RNA聚合酶基因 的大肠
7、杆菌中,即可开始产生蛋白了。这些菌株都是DE3溶原菌。噬菌体DE3是一种衍生噬菌体,带有噬菌体21抗性区和lacI基因,lacUV5启动子,以及T7RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因,因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出,一旦形成DE3溶原状态,就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7RNA聚合酶基因转录。BL21(DE3)BL21(DE3)是应用最广泛的表达宿主菌。是lon蛋白酶和ompT膜外蛋白酶(纯化过程可以降解蛋白)缺陷型。目的蛋白BL21中更加稳定。因为BL21(DE3)对利福平敏感,如果有必要可以用利福平来限制宿主RNA和蛋白质的背景合成。
8、应该注意一些带有T7启动子的商业载体原则上可以用来表达,然而,只有T7启动子而没有额外的lac阻遏子基因的载体并不适合。这些载体上的多拷贝lac操纵 子(用于蓝白斑筛选)会结合lac抑制因子,使pet菌株中同样受lac抑制因子控制的基因部分表达。结果基本的T7RNA聚合酶活性升高,使目的基因的稳定性受到影响。lacUV5 Promoter与野生型lac启动子相比,控制T7RNA聚合酶表达的 lacUV5启动子对 cAMP/CRP的刺激并不敏感。然而,最近研究发现rDE3宿主菌在缺少葡萄糖的培养基生长到稳定期时,cAMP同样对lacUV5产生了去阻遏作用。尽管宿主菌长到稳定期并不推荐,菌体培养过
9、夜(16h)后转入含有1%的葡萄糖的培养基中,可以有效避免去阻遏作用,因为glucose可以cAMP的产生。T7lac PromoterT7启动子下游有个Lac启动子,它包含常规的启动子和lacI基因,T7lac与lacI启动子位置交错。采用这种载体及DE3溶原菌,lac阻遏蛋白可以作用与T7RNA聚合酶,也作用与载体T7lac启动子。阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLysS和pLysE宿主菌另一个为目的基因提供稳定性保证的方法是在拥有兼容的氯霉素抗性编码表达少量T7溶菌酶(T7RNA聚合酶天然抑制物)的宿主中表达。T7RNA溶菌酶是一种双功能蛋白,它能够切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖
10、层,也可与聚合酶结合,阻止转录。pLysS(or pLysE)有助于目的蛋白的抽提The presence of pLysS(or pLysE)has the further advantage of facilitating the preparation of cell extracts.After the target protein has accumulated,the cells are collected and suspended in a buffer such as 50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA,pH 8.0.Simply freezing and th
11、awing,or adding 0.1%Triton X-100,will allow the resident T7 lysozyme to efficiently lyse the cells.This property can make it advantageous to carry pLysS in the cell even when it is not required for stabilizing the target plasmid.载体与宿主共同影响表达水平实际操作中,通常要尝试多种不同的载体/宿主菌组合以期获得拥有正确结构的目的蛋白的高水平表达。The pET Syst
12、em Process Prepare pET Vector Prepare Insert DNA Clone Insert into pET Vector Transform into Expression Host Induce and Optimize Expression of Target Protein Scale-up Purify Target ProteinPCR法制备插入片段有引入突变的风险,可以采用以下方法降低PCR反应的突变:采用高保真的酶减少循环数增加模板浓度增加引物浓度片段与载体连接For a standard reaction using DNA fragments
13、with 24 base sticky ends,use 50-100 ng(0.0150.03 pmol)of pET vector with 0.2 pmol insert(50 ng of a 500 bp fragment)in avolume of 20l.Assemble the following components in a 1.5 ml tube(these components are available separately in the DNA Ligation Kit,Cat.No.69838-3).Add the ligase last.1.1.接菌于接菌于LBL
14、B液体培养基,摇过夜液体培养基,摇过夜.2.2.取取1.5ml1.5ml于于EPEP管,管,12,000 g离心1min.彻底去除上清.3.用100ul solutionI悬浮菌体.4.加200ul新鲜配制的0.2 N NaOH,1%SDS,颠倒混匀,冰上放置3min.5.加150ul150 l of ice-cold 3 M NaOAc,pH 5.2。颠倒混匀,冰上放置5min。6.12000rpm,离心5min。转移上清到一个新的Ep管。7.加400 l TE-buffered phenol:chloroform:isoamyl alcoho(25:24:1),涡旋震荡30s。8.12,0
15、00 g for 5 min at 4C.9.倒掉上清,加400ul乙醇。10.重悬沉淀,30ul含20ug/mlRNAse的TEbuffer。37放置15min。质粒小量制备solutionI(ice-cold 50 mM glucose,25 mM Tris-HCl pH 8.0,10 mMEDTA预冷)表达宿主菌的诱导For pET constructions carrying the“plain”T7 promoter,a final concentration of 0.4 mM IPTG is recommended,while 1 mM IPTG is recommended w
16、ith vectors having the T7lac promoter.An准备诱导表达准备诱导表达Pick a single colony from a freshly streaked plate and inoculate 50 ml LB containing the appropriate antibiotic in a 250 ml Erlenmeyer flask.(For good aeration,add medium up to only 20%of the total flask volume.)另一种诱导方法Alternatively,inoculate a sin
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