重组基因的导入和鉴定.pptx

1 1 构建重组体DNA是分子生物学常用技术。它把经过处理的、具有匹配末端的外源片段和载体进行连接,转化感受态细菌后,经生长、筛选或鉴定,获得含目的DNA 的转化菌。本章讨论外源重组基因转入受体细胞的方法，及其重组子的鉴定。2 2 第一节第一节 基因转移的方法基因转移的方法n n在确定染色体DNA是遗传的主要载体后的一段较长时间内，人们一直认为虽然生物种类繁多，表型各异，但决定每种生物基因组的DNA是固定的，包括数目固定、位置固定、功能固定的一系列基因。他们的流动性受到十分严格的限制。3 3n n随着遗传学研究的深入，人们逐渐发现细菌的结合、转导、转化、转座等现象，在这些事件中存在明显的遗传物质转移，而这种转移与生物繁殖过程中的遗传物质的转移有显著区别。这些现象后来成为基因工程的基因转移技术。可以用于细菌、真菌和动、植物的基因工程体构建。4 4一、基因转移的物理方法一、基因转移的物理方法n n裸DNA直接注射n n微粒轰击n n电穿孔n n显微注射物理方法物理方法5 5(1)裸DNA直接注射n n19901990年年WolffWolff等首次注意到给小鼠直接肌肉注等首次注意到给小鼠直接肌肉注射纯化的射纯化的DNADNA或或RNARNA重组表达载体，可使载体重组表达载体，可使载体上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可持续数日或更长时间，且没有检出注射的外持续数日或更长时间，且没有检出注射的外源核酸与宿主染色体整合。源核酸与宿主染色体整合。n n随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNADNA接种后可诱导机体产生细胞及体液免疫。接种后可诱导机体产生细胞及体液免疫。于是，作为一种新的基因治疗手段于是，作为一种新的基因治疗手段核酸核酸免疫技术应运而生。免疫技术应运而生。6 67 78 89 9提高转化效率措施提高转化效率措施n n实验表明，实验表明，横纹肌细胞(如心肌、骨傍肌)和胸腺滤泡细胞摄取摄取DNADNA的能力较强，但实的能力较强，但实际上质粒际上质粒DNADNA注射入肌组织后，最多只有注射入肌组织后，最多只有1 1-2 2的肌纤维被转染，的肌纤维被转染，DNADNA的转染效率不仅与的转染效率不仅与质粒质粒DNADNA的大小、构型有关，还与肌细胞的状的大小、构型有关，还与肌细胞的状态有十分密切的关系。态有十分密切的关系。n n人们为提高肌细胞摄取人们为提高肌细胞摄取DNADNA的能力采取了一些的能力采取了一些措施，如在质粒接种前先措施，如在质粒接种前先给予高渗蔗糖溶液、心肌毒柬或麻醉剂(如利多卡因)的预处理。1010(2)(2)基因枪介导的皮内或皮下导入基因枪介导的皮内或皮下导入n n首先利用微小的金、钨等金属颗粒相首先利用微小的金、钨等金属颗粒相DNADNA吸附，吸附，然后在高压作用下将然后在高压作用下将DNADNA伴随金颗粒高速进入伴随金颗粒高速进入细胞，由于微粒的直径一般在细胞，由于微粒的直径一般在0.5-0.9 Fm0.5-0.9 Fm之间，之间，远小于细胞远小于细胞n n因此可直接将因此可直接将DNADNA导入细胞质中，这种方法能导入细胞质中，这种方法能有效地使有效地使DNADNA在活体组织、贴壁细胞和悬浮细在活体组织、贴壁细胞和悬浮细胞中表达。由于该方法的高转染效率，通常只胞中表达。由于该方法的高转染效率，通常只得少量得少量DNADNA即可获得外源基因的表达并激发有即可获得外源基因的表达并激发有效免疫应答。效免疫应答。1111 8080年代末期，由康奈尔大学的年代末期，由康奈尔大学的SanfordSanford最先提出，主要最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。是为了克服以往各种基因转化技术的局限。该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。(2)(2)基因枪介导的皮内或皮下导入基因枪介导的皮内或皮下导入1212(2)(2)基因枪介导的皮内或皮下导入基因枪介导的皮内或皮下导入首先将钨、金微粒首先将钨、金微粒(直径约直径约0.4m0.4m，重量约，重量约0.05mg)0.05mg)与供体与供体DNADNA溶溶液液(1(12l)2l)混合并保温，使混合并保温，使DNADNA吸附在金属微粒的表面，然后吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的将该溶液置于所谓的“基因枪基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的钨粒上的DNADNA以及溶液中的以及溶液中的DNADNA都可以进入受体细胞。都可以进入受体细胞。操作技术程序为：操作技术程序为：131314141515基因枪所用材料：（1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。（2）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。（3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。基因枪法的特点：（1）转化效率高。（2）受体广泛。（3）操作简单。1616(3)(3)电穿孔电穿孔(electroperation)(electroperation)n n该方法利用脉冲电场提该方法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，使高细胞膜的通透性，使细胞膜上形成纳米大小细胞膜上形成纳米大小的微孔，可将的微孔，可将DNADNA转移到转移到细胞中。该方法简便，细胞中。该方法简便，且有较稳定的转染效率，且有较稳定的转染效率，可广泛运用于培养细胞可广泛运用于培养细胞的基因转移的基因转移.1717原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（一种电容，其静膜电位（VmVm）约为）约为l00mVl00mV，导电性很差。当，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。1818操作程序：操作程序：将盛有细胞和将盛有细胞和DNADNA混合物的特制小混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，容器置于电脉冲仪的正负极之间，在在0 0度度下加高压（下加高压（2 2 4KV4KV），电脉），电脉冲冲1010分钟后，将待处理的细胞转移分钟后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长到新鲜培养基中生长2 2天，再进行天，再进行筛选。存活细胞的回收率约为筛选。存活细胞的回收率约为60%60%80%80%。1919(4)(4)显微注射显微注射n n指在显微镜下，将指在显微镜下，将DNADNA由细胞玻璃针直接注入由细胞玻璃针直接注入细胞。可以将细胞。可以将DNADNA直接直接注入核内而减少溶酶体注入核内而减少溶酶体对外源对外源DNADNA的降解，有的降解，有助于基因的整合与表达。助于基因的整合与表达。n n适用于多种贴壁生长细适用于多种贴壁生长细胞及悬浮生长细胞，包胞及悬浮生长细胞，包括原代及传代细胞、胚括原代及传代细胞、胚胎细胞等。胎细胞等。2020微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNADNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头道进入。道进入。真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源源DNADNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。(4)(4)显微注射显微注射2121固定细胞技术n显微注射技术的关键是原生质体或具壁显微注射技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。细胞或细胞团的固定。n首先必须建立固定细胞技术，然后才能首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。进行定位显微注射操作。n常用的细胞固定方法有常用的细胞固定方法有3 3种：种：一、琼脂糖包埋法一、琼脂糖包埋法二、多聚赖氨酸粘连法二、多聚赖氨酸粘连法三、吸管支持法三、吸管支持法2222二、基因转移的化学方法二、基因转移的化学方法n n化学方法化学方法n n磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法n nDEAEDEAE葡聚糖转染法葡聚糖转染法n n脂质体转染法脂质体转染法2323(1)磷酸钙共沉淀法n n当当CaCl2CaCl2、DNADNA和磷酸盐缓冲液缓慢混合和磷酸盐缓冲液缓慢混合时，即有时，即有磷酸钙微细沉淀磷酸钙微细沉淀形成，这些形成，这些细小颗粒可以吸附在细胞表面，通过细细小颗粒可以吸附在细胞表面，通过细胞膜的内吞作用将胞膜的内吞作用将DNADNA吸收进入细胞质吸收进入细胞质面后进入细胞核，其详细机制尚不明确。面后进入细胞核，其详细机制尚不明确。n nDNADNA多以多以多拷贝首尾相连多拷贝首尾相连的串珠状排列的串珠状排列进入细胞，在细胞中常以多拷贝形式存进入细胞，在细胞中常以多拷贝形式存在。在。24242525n n该方法操作简单，又不需特殊仪器，瞬间转移效率最高可达到20，但长期表达效率较低，目前已被广泛运用于离体细胞的基因转移，是最普遍使用的方法之一。2626(2)DEAE-(2)DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法n n二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子量的多聚阴二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子量的多聚阴离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNADNA，因此被用于基因转染技术。其促进细胞捕，因此被用于基因转染技术。其促进细胞捕获获DNADNA的机制还不清楚，可能是因为葡聚糖与的机制还不清楚，可能是因为葡聚糖与DNADNA形成复合物而抑制了核酸酶对形成复合物而抑制了核酸酶对DNADNA的作用，的作用，也可能是葡聚糖与细胞结合面引发了细胞的也可能是葡聚糖与细胞结合面引发了细胞的内吞作用。该方法可广泛用于转染病毒、病内吞作用。该方法可广泛用于转染病毒、病毒序列及其他毒序列及其他DNADNA，适合于细胞瞬间表达检测，适合于细胞瞬间表达检测及小量及小量DNADNA的转染。的转染。2727(3)(3)脂质体转染法脂质体转染法n n将磷脂、胆固醇或其他脂类的乙醚溶液加入到DNA溶液中，经特殊处理得到单层或双层的带DNA的脂质体小泡，通过与细胞膜融合，被细胞内吞而实施基因转移。这类方法基因转移效率很高，据报道最高时，100离体细胞可以瞬时表达外源基因。2828三、基因转移的生物方法三、基因转移的生物方法(一）载体介导一）载体介导一）载体介导一）载体介导质粒质粒TiTi质粒质粒-土壤根瘤菌土壤根瘤菌RiRi质粒质粒-发根土壤根菌发根土壤根菌逆转录病毒逆转录病毒(Rv)(Rv)载体载体腺病毒腺病毒(Ad)(Ad)载体载体腺相关病毒腺相关病毒(AAv)(AAv)载体载体单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒(HSv)(HSv)载体载体嵌合病毒载体嵌合病毒载体病毒病毒2929质粒n n两种病原土壤杆菌根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根土壤根菌(Agrobacterium rhizogenes)分别含有Ti和Ri质粒为基因克隆载体介导的基因转移。303031311 1、共培养法、共培养法(cocultivation)(cocultivation)MartonMarton等等19791979年以原生质体为受体建立，随后经过一系列的改年以原生质体为受体建立，随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。进，现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。主要原理是将受体与供体在一起培养，通过接触感染而发生转主要原理是将受体与供体在一起培养，通过接触感染而发生转移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式。移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式。（一）载体介导的转化方法3232（1 1）原生质体共培养法）原生质体共培养法 取含重组取含重组TiTi质粒的农杆菌同刚刚长质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。质的转化。1 1、共培养法、共培养法(cocultivation)(cocultivation)3333从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养2424小时。小时。原原生生质质体体与与农农杆杆菌菌混混合合培培养养，原原生生质质体体浓浓度度l0l05 5mlml、农农杆杆菌菌l0l07 7mlml，2020下保温下保温3232小时。小时。冲冲洗洗去去游游离离的的细细菌菌，将将原原生生质质体体培培养养在在有有抗抗生生素素(250mg(250mgL L万万古古霉霉素素，200mg200mgL L羧羧苄苄青青霉霉素素，200mg200mgL L链链霉霉素素)的的培培养养基基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。3 3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2 2周内，周内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。烟草原生质体与烟草原生质体与TiTi质粒转移的共培养法程序为质粒转移的共培养法程序为：34343535（2）叶盘共培养法 该方法最早由该方法最早由Horsch(1985)Horsch(1985)首创，首创，用于烟草转化用于烟草转化 。优点：适用性广，对于那些能优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种植物均适用。再生植株的各种植物均适用。3636（3）悬浮细胞或愈伤组织共培养 原则上，该种共培养与原生质体共培养的原则上，该种共培养与原生质体共培养的方法和步骤是相同的，在供体上，则必方法和步骤是相同的，在供体上，则必须是有侵染和感染能力的载体系统，如须是有侵染和感染能力的载体系统，如带有带有TiTi质粒的根癌农杆菌。质粒的根癌农杆菌。3737所谓整体植株接种转化法，是指人为地在所谓整体植株接种转化法，是指人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植物体内，使农杆菌按照天然的注射到植物体内，使农杆菌按照天然的感染过程在植物体内进行侵染，获得转感染过程在植物体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。接种化的植物愈伤组织或转基因植株。接种后后2-32-3周，切下接种处部分组织培养周，切下接种处部分组织培养4 4周，周，可产生愈伤组织，进一步通过分化培养可产生愈伤组织，进一步通过分化培养可获得转基因植株。可获得转基因植株。（4 4）活体接种）活体接种(inoculation in vivo)(inoculation in vivo)38382 2、病毒介导的基因转移、病毒介导的基因转移 （1 1 1 1）双链）双链）双链）双链DNADNADNADNA病毒转化载体病毒转化载体病毒转化载体病毒转化载体 这类病毒是以双链这类病毒是以双链DNADNA作为遗传物质，在这类病毒中，目前作为遗传物质，在这类病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花叶病毒（简称研究的最多的是花椰菜花叶病毒（简称CaMV,Caullinus CaMV,Caullinus Mozic VirusMozic Virus）。）。（2 2）单链）单链DNADNA病毒转化载体病毒转化载体 GeNVGeNV顾名思义，可翻译成顾名思义，可翻译成“双联体病毒双联体病毒”或或“孪生病毒孪生病毒”。GeNVGeNV的感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传的感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传播媒介是昆虫。播媒介是昆虫。（3 3）单链）单链RNARNA病毒转化载体病毒转化载体 迄今为止，还没有建立起一个完善的以植物迄今为止，还没有建立起一个完善的以植物RNARNA病毒为基因病毒为基因载体的基因转化体系，但是载体的基因转化体系，但是RNARNA病毒仍是一个很有希望作为病毒仍是一个很有希望作为基因工程载体的植物基因工程载体的植物病毒。39393 3 花粉管通道花粉管通道n n在授粉后向子房注射合目的基因的在授粉后向子房注射合目的基因的DNADNA溶液，利用植溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNADNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。个体。n n该方法于该方法于8080年代初期由我国学者周光宇提出，我国目年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。培育出来的。n n该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。易于掌握。40404 4 叶绿体基因组转化叶绿体基因组转化n n1990年Svab 等利用基因枪轰击法获得烟草叶绿体转基因植株。n n叶绿体基因组转化技术在外源基因的导入,外源基因的整合与表达,转基因植株的筛选等方面都取得了长足的发展。n n到目前为止,叶绿体基因组转化技术已在烟草、拟南芥、马铃薯、油菜、番茄和水稻等高等植物中获得了成功。4141第二节第二节 重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定一、遗传检测法一、遗传检测法二、物理检测法二、物理检测法三、菌落或噬菌斑杂交筛选法三、菌落或噬菌斑杂交筛选法四、免疫化学检测法四、免疫化学检测法四、免疫化学检测法四、免疫化学检测法 五、五、五、五、DNA-DNA-DNA-DNA-蛋白质筛选法蛋白质筛选法蛋白质筛选法蛋白质筛选法 六、转译筛选法六、转译筛选法4242一、遗传检测法一、遗传检测法 1 1、根据载体表型特征选择重组体分子、根据载体表型特征选择重组体分子 质粒、柯斯载体质粒、柯斯载体质粒、柯斯载体质粒、柯斯载体-抗药性记号或营养记号抗药性记号或营养记号抗药性记号或营养记号抗药性记号或营养记号 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体-噬菌斑噬菌斑噬菌斑噬菌斑 4343n np pB BR322R322质粒质粒-四环素抗性基因四环素抗性基因(tetr)(tetr)和氨卞和氨卞青霉素抗性基因青霉素抗性基因(ampr)(ampr)。n n将转化的细胞培养在含有四环素或氨卞青霉素将转化的细胞培养在含有四环素或氨卞青霉素的生长培养基中的生长培养基中,检测出获得了此种质粒的转化检测出获得了此种质粒的转化子细胞。子细胞。4444插入失活效应插入失活效应(Insertional(Insertional inactivation)inactivation)n n检测外源检测外源DNADNA插入的方法插入的方法n n在在pBpBR322R322质粒的质粒的DNADNA序列上有序列上有许多种不同的核酸内切限制许多种不同的核酸内切限制的识别为位点都可以接受外的识别为位点都可以接受外源源DNADNA的插入。的插入。n n如携带在如携带在amprtetramprtetr基因的基因的pBR322pBR322质粒质粒,当其当其tetrtetr基因基因中插人外源中插人外源D DNANA片段时，其片段时，其宿主细胞表型变为宿主细胞表型变为amprtets,amprtets,可以通过这种方可以通过这种方法筛选出重组体分子。法筛选出重组体分子。4545插入失活法筛选重组子插入失活法筛选重组子4646半乳糖苷酶显色反应半乳糖苷酶显色反应n npUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，在应用pUC18质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。4747lacZlacZN端端 C端端缺陷型大肠杆菌缺陷型大肠杆菌完整的完整的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶4848重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19pUC18/19pUC18/19：正选择标记正选择标记正选择标记 lacZlacZlacZ 的显色原理的显色原理的显色原理pUC18/19pUC18/19pUC18/19PlacPlacPlaclacZlacZlacZ MCSMCSMCSb-b-b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a-a-a-肽段肽段肽段a a ab b b5-5-5-溴溴溴-4-4-4-氯氯氯-3-3-3-吲哚基吲哚基吲哚基-b-D-b-D-b-D-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷X-galX-galX-gal4949互补显色反应 50502 2 根据插入序列的表型特征选择重组根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法体分子的直接选择法外源基因能够表达，可以根据表型特征的直接选择。基本原理：转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。5151n n例如，编码大肠杆菌生物合成基因克隆的外例如，编码大肠杆菌生物合成基因克隆的外源源DNADNA片段，对于大肠杆菌寄主菌株不可逆的片段，对于大肠杆菌寄主菌株不可逆的营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特性，我们便可以分离到获得了这种基因的重性，我们便可以分离到获得了这种基因的重组体克隆。目前已拥有相当数量的对其突变组体克隆。目前已拥有相当数量的对其突变作了详尽研究的大肠杆菌实用菌株。而且其作了详尽研究的大肠杆菌实用菌株。而且其中有许多种类型的突变，只要克隆的外源基中有许多种类型的突变，只要克隆的外源基因产物获得低水平的表达，便会破抑制或发因产物获得低水平的表达，便会破抑制或发生互补作用。应用类似的方法成功地分离了生互补作用。应用类似的方法成功地分离了小鼠的二氢叶酸还原酶小鼠的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate(dihydrofolate reductase,DHFR)reductase,DHFR)基因。基因。5252n n这种筛选法受一定的条件限制，它不单要求克隆的这种筛选法受一定的条件限制，它不单要求克隆的DNADNA片段必须大到足以包含一个完整的基因序列，而片段必须大到足以包含一个完整的基因序列，而且还要求所编码的基因应能够在大肠杆菌寄主细胞中且还要求所编码的基因应能够在大肠杆菌寄主细胞中实现功能表达。无疑，真核基因是难以满足这些要求实现功能表达。无疑，真核基因是难以满足这些要求的。其原因在于有许多真核基因是不能同大肠杆菌的的。其原因在于有许多真核基因是不能同大肠杆菌的突变发生抑制作用或互补效应的。此外，大多数的真突变发生抑制作用或互补效应的。此外，大多数的真核基因内部都存在着间隔序列，而大肠杆菌又不存在核基因内部都存在着间隔序列，而大肠杆菌又不存在真核基因转录加工过程中所需要的剪辑机理，这样便真核基因转录加工过程中所需要的剪辑机理，这样便阻碍了它们在大肠杆菌寄主细胞中实现基因产物的表阻碍了它们在大肠杆菌寄主细胞中实现基因产物的表达，当然，在有些情况下可以通过使用达，当然，在有些情况下可以通过使用mRNmRNA A的的cDNAcDNA拷拷贝构建重组体贝构建重组体DNADNA的办法，来克服这类问题。的办法，来克服这类问题。5353n n在利用噬菌体载体筛选重组体时，主要依赖重组DNA的大小及形成噬菌斑的能力，只有当重组体DNA是野生型DNA的75-l05的长度时，才能在培养平板上形成“清晰的噬菌斑”，而单一载体DNA是不会包装成活的噬菌体颗粒的。经体外包装及转导后能否形成清晰的噬菌斑，尤其是对替换型噬菌体载体，本身就是一种可利用的选择标记。5454二、物理检测法二、物理检测法n n1 凝胶电泳检测法 证明重组体质粒在分子量上的增加,一种直截了当的方法是分离质粒的DNA并测定其分子长度。对此。电子显微镜测定无疑是有效的方法，但对于以筛选为目的实验来说,则显得过于烦琐。因此,常用操作程序比较简单的凝胶电泳测定法来代替。5555n n带有外源DNA插入序列、分子量较大的重组体DNA在凝胶中的迁移速率，比不具有外源DNA插入序列、分子量较小的质粒DNA来得缓慢些。n n根据这种差别就可以容易地鉴定出哪些菌落是含有外源DNA插入序列的分子量较大的重组质粒。5656物理检测法 凝胶电泳检测法凝胶电泳检测法57572 R2 R环检测法环检测法n n采用mRNA作探针的核酸杂交法，来检测具有外源DNA插入片段的重组体分子。n n一种是R-环检测法，另一种是放射性探针检测法。5858在临近双链在临近双链DNADNA变变性温度下和高浓性温度下和高浓度度(70(70)的甲酰的甲酰胺溶液中胺溶液中,双链双链的的DNA-RNADNA-RNA分子分子稳定。稳定。5959n n这种由单链这种由单链D DNANA分支和双链分支和双链DNA-RNADNA-RNA分支形成分支形成的的“泡状泡状”体体,叫做叫做R-R-环结构。可以在电子显环结构。可以在电子显微镜下观察到。可以鉴定出双链微镜下观察到。可以鉴定出双链DNADNA中存在的中存在的与特定与特定RNARNA分子同源的区域。分子同源的区域。n n使待检测纯化的质粒使待检测纯化的质粒DNADNA，在含，在含mRNAmRNA分子的缓分子的缓冲液中局部的变性。如果质粒冲液中局部的变性。如果质粒DNADNA分子上存在分子上存在着与着与mRNAmRNA探针互补的序列，那么这种探针互补的序列，那么这种m mRNARNA就就将取代将取代DNADNA分子中的相应的互补链，形成分子中的相应的互补链，形成R-R-环环结构。然后放置在电子显微镜下观察结构。然后放置在电子显微镜下观察,这样使这样使可以检测出重组体质粒的可以检测出重组体质粒的DNADNA分子分子6060三、菌落或噬菌斑杂交筛选法三、菌落或噬菌斑杂交筛选法n n核酸杂交检测法：应用放射性标记的特定的DNA或RNA作探针，进行DNA/DNA或DNARNA杂交。n n最早由M.Grunstein和D.Hogness(1975)发明应用放射性标记的探针原位筛选重组体菌落的方法。n n经过D.Hanahan和M.Meselson(1980)的改良可适用于高密度的菌落杂交筛选。6161菌落原位杂交是先将要筛选的菌落影印到平板表面的硝酸纤维素滤膜上，继续培养至生长出菌落，取出长有菌落的滤膜，用碱处理裂解菌体，再将膜用蛋白酶K处理以除去蛋白质。在80烘烤膜以固定DNA，最后用探针进行杂交，并参照放射自显影底片上的曝光点，从平板上的相应位置挑出阳性菌落。6262例：例：例：例：原位杂交筛选重组原位杂交筛选重组原位杂交筛选重组原位杂交筛选重组体菌落体菌落体菌落体菌落(或噬菌斑或噬菌斑或噬菌斑或噬菌斑)63636464n n噬菌斑原位杂交是将膜上结合的噬菌斑原位杂交是将膜上结合的DNADNA进行变性、进行变性、固定、杂交和放射自显影。将重组体中的固定、杂交和放射自显影。将重组体中的DNADNA纯化出来进行电泳转移，可以检测重组体中纯化出来进行电泳转移，可以检测重组体中与探针与探针DNADNA同源的序列，这一方法称为同源的序列，这一方法称为“SouthernSouthern印迹法印迹法”。n nSouthernSouthern印迹杂交是印迹杂交是DNADNA的吸印转移，相应的的吸印转移，相应的还有只还有只RNARNA相蛋白质的吸印转移，分别称为相蛋白质的吸印转移，分别称为“NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交”和和“WesternWestern印迹杂交印迹杂交”。65656666四、免疫化学检测法四、免疫化学检测法 免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。常用的有常用的有常用的有常用的有标记抗体测定法标记抗体测定法和和免疫沉淀测定法免疫沉淀测定法两种两种两种两种 。6767四、免疫化学检测法四、免疫化学检测法转化菌落转化菌落转化菌落转化菌落影印平板影印平板影印平板影印平板置于含氯仿饱合气体的容器置于含氯仿饱合气体的容器置于含氯仿饱合气体的容器置于含氯仿饱合气体的容器细菌裂解，抗原释放细菌裂解，抗原释放细菌裂解，抗原释放细菌裂解，抗原释放覆盖吸附有未经标记的抗体的覆盖吸附有未经标记的抗体的覆盖吸附有未经标记的抗体的覆盖吸附有未经标记的抗体的NCNCNCNC膜膜膜膜形成抗原抗体复合物形成抗原抗体复合物形成抗原抗体复合物形成抗原抗体复合物将将将将NCNCNCNC膜与膜与膜与膜与I I I I125125125125标记的抗体温育标记的抗体温育标记的抗体温育标记的抗体温育 放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影与母板对照，挑取所需的重组克隆与母板对照，挑取所需的重组克隆与母板对照，挑取所需的重组克隆与母板对照，挑取所需的重组克隆 标记抗体测定法的步骤：标记抗体测定法的步骤：标记抗体测定法的步骤：标记抗体测定法的步骤：6868用免疫化学法检测克隆在表达载体用免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因上的基因6969五、五、DNA-DNA-蛋白质筛选法蛋白质筛选法n nDNA-蛋白质筛选法(Southwestern screening)是专门设计用来检测同DNA特异性结合的蛋白质因子的一种方法。n n用于筛选并分离表达融合蛋白质的克隆。合成此种融合蛋白质的重组DNA分子中的外源DNA序列，编码一种能专门同某一特定DNA序列结合的DNA结合蛋白质(DNA-binding protein)。7070五、DNA-蛋白质筛选法 原理：原理：外源外源DNADNA蛋白质蛋白质翻译翻译能与某一能与某一特定特定DNADNA序列结合序列结合作为探针与克隆群体杂交作为探针与克隆群体杂交