八高效液相色谱.pptx

二、高效液相色谱原理二、高效液相色谱原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）第1页/共40页三、三、HPLCHPLC的特点的特点 HPLC在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。1.高压高压：由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa。2.高速高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC稍慢。第2页/共40页 3.高效高效：由于HPLC的柱效较高(每米塔板数可达5000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。4.高灵敏度高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10-9g乃至10-11g 的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展。一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点当其相对分子质量小、沸点较低时，可用较低时，可用GCGC进行分析；当沸点较高进行分析；当沸点较高(450)450)、不能气化或、不能气化或热稳定性差者，可用热稳定性差者，可用HPLCHPLC分析分析；如果条件不允许，无法购置昂贵的仪器时，可用TLC等经典液相色谱进行分析。第3页/共40页高效液相色谱系统第4页/共40页第5页/共40页液相色谱仪器液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph第6页/共40页液相色谱仪（液相色谱仪（2 2）第7页/共40页液相色谱仪（液相色谱仪（3 3）第8页/共40页四、四、HPLCHPLC的分类的分类 HPLC可以分为很多类别，按分离机制可分以下几种主要类型。1.1.液固吸附色谱液固吸附色谱 以吸附剂为固定相，以不同极性的溶剂为流动相，根据试样中各组分吸附能力的不同而进行分离的方法，称液相吸附色谱。在HPLC中常用全多孔型硅胶微粒为吸附剂，直径5-10m，由于颗粒小且多孔，故柱效很高。2.2.液液-液分配色谱液分配色谱 流动相与固定相均为液体的色谱法，称液-液分配色谱法或简称液-液色谱法，按照固定相和流动相极性的差别，可分为正相与反相色谱法两类。第9页/共40页 (1)(1)正相液液色谱法正相液液色谱法 流动相极性小于固定相的液-液色谱法称正相液-液色谱法。洗脱时，极性小的组分先流出色谱柱，极性大的组分在固定相中溶解度大，后流出色谱柱。原始的正相色谱以含水硅胶为固定相，以烷烃等为流动相，由于固定液易流失，已被化学键合相色谱法取代。化学键合相是将固定液用化学键键合在载体表面形成的固定相。正相色谱常用的氰基键合相，性质与硅胶类似，只是保留时间略小。氨基键合相的氨基为碱性，与硅胶的性质差异较大，常用于糖类的分析。正相色谱以有机溶剂为流动相，使用成本较高。第10页/共40页(2)(2)反相液反相液-液色谱法液色谱法 流动相极性大于固定相的液-液色谱法称反相液-液色谱法，洗脱时样品中极性大的组分先流出色谱柱。为了防止固定液的流失，反相色谱法均使用化学键合相，典型的反相化学键合相，用多孔性载体上化学键合的十八烷基(octadecysilyl,缩写ODS 或C18)为固定相，流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，由弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相构成。反相键合色谱法固定相不流失，流动相以水为主，用甲醇或乙腈调节极性，应用范围很宽，且使用成本低，在HPLC中应用最广。第11页/共40页1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液极性 固定液非极性3正相色谱正相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分,流动相为正己烷等。流动相为正己烷等。反相色谱反相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分，流动相主要为甲醇或水的溶适于分离非极性组分，流动相主要为甲醇或水的溶 液等，液等，液液分配色谱法总结液液分配色谱法总结第12页/共40页五、五、HPLCHPLC的仪器构成的仪器构成 高效液相色谱仪通常由溶剂输送系统、进样系统、色谱分离系统和检测记录系统四部分组成。1.1.高压泵：高压泵：由于HPLC的固定相颗粒很小，柱阻力很大，故载液必须用高压泵来输送，通常柱前压达15-30MPa，才能获得高速的液流，以达到快速分离目的。载液要预先脱气，流路中不应产生气泡，并要避免尘粒，以免堵塞泵和柱子，故使用前载液常在减压下通过0.45m的滤膜进行过滤和脱气。有时还用梯度洗脱装置，使载液的组成(浓度、离子强度、极性和pH值)随时间而连续改变，以提高色谱分离的效果。第13页/共40页 2.2.进样系统：进样系统：为了将试样有效地送入色谱柱，可用微量注射器通过六通进样阀的进样口注入样液；亦可将样液先注入与柱头相连的贮样环管，然后利用切换阀让载液将样品定量地送入色谱柱。3.3.色谱柱：色谱柱：HPLC所用的色谱柱大多为内径2mm、长度0.3m左右的直形短柱。固定相可通过干法或湿法在高压下装入色谱柱，要求填充均匀。多数使用者可直接购置各种类型的预装柱，在使用过程中由于杂质污染往往使柱效逐渐降低，因此，每次测定后要用流动相慢速(0.1mL/min)冲洗柱子，使其再生。加预柱也是保护色谱柱延长使用寿命的好办法。第14页/共40页色谱柱的构成色谱柱的构成 色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10 粒径的球形颗粒。色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。色谱柱：也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的。第15页/共40页 柱体为直型不锈钢管，内径1-6 mm，柱长5-40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。第16页/共40页 4.4.检测器：检测器：用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。目前应用较多的是紫外检测器、差示折光检测器和荧光检测器。第17页/共40页 4.4.检测器：检测器：用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。目前应用较多的是紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器。第18页/共40页 a.a.紫外检测器紫外检测器是基于试样中的待测组分对特定波长的紫外光有选择性的吸收，其吸光度与组分消光度成正比的关系进行检测的。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。第19页/共40页 a.紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。第20页/共40页b.b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第21页/共40页第22页/共40页 示差折光检测器示差折光检测器是利用连续测定流通池中溶液折射率的变化来测定试液浓度的检测器。由于溶有待测组分的流动相与参比流动相之间折射率的差值，与待测组分在流动相中的浓度成正比，故可根据折射率的改变来测定待测组分的含量。原理原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。第23页/共40页 绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以是一种通用的检测方法。虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。第24页/共40页c.示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive index detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；第25页/共40页示差折光检测器示差折光检测器第26页/共40页 荧光检测器荧光检测器是根据某些物质在紫外光照射下具有荧光的特性来检测的，具有很高的灵敏度，适用于检测有-共轭体系的大分子及结构复杂的化合物，如蛋白质、氨基酸、维生素、稠环芳烃等。有些无-共轭体系的分子通过柱前衍生法引入荧光基团亦可用荧光检测器检测。第27页/共40页 原理：原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。特点：特点：有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。第28页/共40页d.荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector）高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；第29页/共40页 5 5、定性定量方法、定性定量方法（数据处理系统）（数据处理系统）HPLC定性、定量的原理与气相色谱法相同，有纯物质标准品时，可用纯物质的保留时间或调整保留时间与样品中相应组分的对比来定性。无纯物质标准品时，通常用HPLC-MS(HPLC-MS(质谱质谱)联联 用仪或用仪或HPLC-FTIRHPLC-FTIR(干涉分光型红外分光光度计)联用等方式定性，但仪器间的接口技术比气相色谱与光谱仪器联用复杂。第30页/共40页 定量方法与气相色谱法基本相同。但由于很难查到相同实验条件下的定量校正因子，故使用校正归一化法较少。由于HPLC进样量较大，而且可以用六通阀定量进样，进样量误差较小，故常用外标法定量，一般要用外标工作曲线法检验线性范围及工作曲线是否通过原点，只有截距为零时，才能用外标一点法定量。为了减小实验条件波动对分析结果的影响，一般每次测定都同时进对照品与样品溶液，称随行外标一点法，定量计算的方法与气相色谱法相同。HPLC的内标法与气相色谱相同，且使用较少。第31页/共40页六六、高效液相色谱仪操作步骤高效液相色谱仪操作步骤1.过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。2.对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3.打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。4.进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。5.冲洗泵：有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。第32页/共40页6.调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。选用合适的流速，走基线，观察基线的情况。7.设计走样方法。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。第33页/共40页8.进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。9.关机时，先关计算机，再关液相色谱。10.登记。第34页/共40页七、七、HPLCHPLC的应用的应用 高效液相色谱法的应用非常广泛，目前，HPLC在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有广泛的用途，而在生物和高分子试样的分离和分析中更是有明显优势。高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：氨基酸及其衍生物；有机酸；甾体化合物；生物硷；抗菌素；糖类；卟啉；核酸及其降解产物；蛋白质、酶和多肽；脂类等。第35页/共40页 1.作为人工合成药物的精制手段，用于除去少量杂质，特别是那些异构体的分离。值得提出的是，药物中R-型和S-型的光学异构体具有不同的生理作用。为了研究药物的作用机制，需要拆分光学异构体(即对映体)，这是很困难的工作，而高效液相色谱在这方面显示了独特的长处。利用不同类型的手性固定相与对映体能生成稳定性不同的非对映异构体，从而达到分离的目的。2.从一些复杂的混合物中排除干扰物质，并分析其中微量成分。3.中草药有效成分的制备和分析。第36页/共40页 4.环境监测和污染物的分析。这在环境污染日益严重的今天是非常重要的。5.食品中营养成分和物质的分析。高效液相色谱为食品成分的分析和定量提供了迅速可靠的途径，如定量分析食品中蛋白质、脂肪、碳水化合物和维生素等含量来确定食品的营养价值和品质。我国高效液相色谱技术在食品卫生领域中的应用始于20世纪70年代末，20世纪90年代后期，国家标准中开始将HPLC法列为检测食品中的营养成分、添加剂、有害物质的等的国标方法。6.手性分离技术目前已成为高效液相色谱十分重要和热门的应用领域。第37页/共40页第38页/共40页八、八、HPLCHPLC与与GCGC差别差别 1 1分析对象的区别分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20%；HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%第39页/共40页2 2流动相差别的区别流动相差别的区别GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。3 3操作条件差别操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）第40页/共40页