亲子鉴定.pptx

亲亲权权鉴鉴定定(identification in disputed paternity)是指应用医学、遗传学、人类学及其他自然科学的理论和技术，主要通过人类遗传标记的检测与分析，对被检者之间是否存在生物学亲缘关系所作的科学判定。亲权鉴定最常见的是判定有争议的父母与子女之间是否有血缘关系，也称为亲亲子子鉴鉴定定。随着越来越多的遗传标记系统的开发和应用，亲权鉴定已不再局限于直接相邻的两代人之间亲缘关系的判定，对同胞间、隔代直系间，以及旁系个体（叔侄、姨甥等）闻的亲缘关系也可能做出相应的判定。一、亲子鉴定案件 亲子鉴定是法医DNA分析应用的一个重要领域，随着技术与经济发展，越来越多的案件涉及到亲子鉴定，亲子鉴定的案件大致有:丈夫怀疑孩子非亲生。非婚生育，男方怀疑孩子非亲生或女方想搞清孩子的生父究竟是谁。强奸致孕，女方指控某男为孩子生父等。认亲、移民、继承财产、上户口。怀疑产房或育婴室调错婴儿。计划生育确认孩子是否为该对夫妇所超生或领养。被拐骗儿童或失散家庭成员的确认。尸体（碎尸块、尸骨等）身份（尸源）确定。需确定现场物证或犯罪嫌疑人衣服或家里斑迹是否为受害人所留，但受害人DNA 已被销毁，无法得到；或如进行强奸案件中精斑同一认定，但嫌疑人在逃，通过亲 子鉴定确认精斑是否为嫌疑人所留。上述 中情况是标准的三联体亲子鉴定三联体亲子鉴定：参加的个体为母、子与假设父，参加的个体为母、子与假设父，母子关系已经确母子关系已经确定无疑定无疑，要求，要求鉴定假设父与孩子之间的亲子关系鉴定假设父与孩子之间的亲子关系；其余 6 种情况涉及可疑父亲、母亲双方的确定。三联体：母-子（儿子或女儿，下同）-男三方均参加检验的情况。这样的鉴定为双亲检验。真三联体：真实存在的母-子-父关系的三联体。假三联体：不存在母-子-父关系的三联体。其中被检验的男子称为假设父亲或被告父亲。如果父母均需要确定的,则称被检验的某男、某女为假设父亲和假设母亲,亦属于双亲检验。二联体：当受检者仅为假设父或假设母和孩子二方时，称二联体。单亲检验：只有父母一方的二联体的亲子鉴定。反转亲子鉴定：指父母已确定，检验孩子是否为他们亲生的亲子鉴定，主要见于失踪者（活体、尸体）的身份确定。二、亲子鉴定应用的遗传标记 遗传标记基因产物水平遗传标记细胞表面的遗传标记（红细胞血型、白细胞血型、血小板型等）蛋白质的遗传标记（血清型、红细胞酶型、血清酶型、唾液型等）DNA水平遗传标记DNA序列多态性DNA长度多态性 应用于亲子鉴定的 DNA 遗传标记系统很多，按遗传方式遗传方式可归纳分为 4 类：1、常染色体上基因座或遗传标记常染色体上基因座或遗传标记，按孟德尔遗传规律传递；2、线粒体线粒体DNADNA非编码区的多态性非编码区的多态性。按母系遗传方式传递，可以确定检验样品是否来自于同一母系，适用于那些父亲不能参加鉴定的母子间的单亲鉴定或同胞之间的或隔代或旁系亲缘鉴定，如再结合孟德尔遗传的遗传标记检验，可以正确确定样品间的亲缘关系；3、Y-Y-染染色色体体上上基基因因座座或或遗遗传传标标记记。按父系遗传方式传递，可以确定样品是否来源于同一父系。适用于那些母亲不能参加鉴定的父子间的单亲鉴定或男性同胞之间或隔代或旁系的亲缘关系鉴定，如再结合按孟德尔遗传的遗传标记检验，可以正确确定样品间的亲缘关系；4、X-X-染染色色体体上上基基因因座座或或遗遗传传标标记记。由于遗传的定向性，它适合三联体的亲子鉴定或除父子关系外的其他单亲的亲缘鉴定。三、亲子鉴定原理三、亲子鉴定原理 亲子鉴定的基本原理有以下两点：在肯定孩子的某个等位基因是来自生父，而被控父亲（AF）并不带有这个基因的情况下，可以排除他是孩子的生父。检查的遗传标记越多，非生物学父亲被排除的概率就越大。在肯定孩子的某些等位基因是来自生父，而AF也带有这些基因的情况下，不能排除他是孩子的生父。这时可以计算如果判断他是孩子生父，理论上的把握度究竟有多大。在一个家庭中，遗传规律可概括为：孩子不可能带有双亲均无的等位基因。孩子必定得到双亲各方的一对等位基因中的一个。除了在双亲都带有相同基因（如A）的情况下，孩子不可能带有两个相同基因（AA）。某个基因在双亲中的一方或双方为纯合子时（AA），必定要在孩子中表现出来（A）。对于父系遗传的Y-染色体的标记，子代的分型必定与父亲的分型一致，而且同一父系的所有个体的分型一致。对于母系遗传的线粒体DNA，子代的分型必定与母亲的分型一致，而且同一母系的所有个体的分型一致。双等位基因遗传标记亲子鉴定的基本遗传原理可以推广到多个等位基因的遗传标记，如STR系统。否定父权 一、排除亲子关系 排除亲子关系可以归纳为如下两种情况：孩子带有母亲和AF双方都没有的一个基因。孩子没有AF必定要传递给其后代的一个基因。根据亲子鉴定原理，AF与孩子在一个遗传标记上不符合遗传规律即可以排除其父子关系，但由于突变的存在，一个不符合遗传规律，可能是由于突变造成的，而且有文献报道在真实的家系中存在两个遗传标记的突变。因此，一个遗传标记的不符合不能否定其亲子关系，要求在2个以上不同基因座同时不符合才能否定其亲子关系。二、非父排除概率 非父排除概率（PE）指不是小孩生父的男子能被遗传标记排除的概率。它是衡量遗传标记系统在亲子鉴定中实它是衡量遗传标记系统在亲子鉴定中实用价值大小的客观指标用价值大小的客观指标。表示在所有非父被控为生父的男子中，用该标记否定父权有多大的可能性。由于亲权鉴定不止使用一个基因座，有必要知道使用的全部遗传标记对于不是小孩生父的男子，否定父权有多大的可能性，即累积非父排除概率（CPE）。累积非父排除概率（CPE）前提条件是一个遗传标记系统独立于另一个系统，计算公式为：CPE1-(1-PE1)(1-PE2)(1-PEk)=1-(1-PEk)式中PEk为第k个遗传标记的PE值。检查多种遗传标记，按各种遗传标记的遗传方式求出PE值后，再按公式求出总的CPE值。注意：基因座多态性程度越高，非父排除概率越高，排除非生物学父亲的能力就越强。所用遗传标记数目越多，累积非父排除概率愈高，鉴定能力愈强。三、错误否定父权的风险 测试的遗传标记增多，遇到遗传变异的可能性也增加。遗传变异使亲子之间的遗传关系呈现为不符合遗传规律。如果缺乏这方面的知识，容易错误否定父权。遗传变异主要有：基因突变、沉默基因、替代等位基因、基因缺失、血型变异、基因互换、弱抗原、嵌合体、镶嵌抗原、生理与病理性变异等。尽管遇到遗传变异的概率很低，但为了避免潜在遗传变异的影响，排除父权至少应根据两个以上遗传标记。1、突变率 基因突变基因突变：减数分裂过程中，存在有基因的交换与重组，或由于某些因素的作用，导致基因的核苷酸顺序发生改变。突变是导致亲代与子代的遗传标记不符合遗传规律的重要原因。突变可能会影响到亲子鉴定结果的正确性，从而对案件的侦破与审判产生误导。因此在亲子鉴定中，应选取那些突变率低的遗传标记。突变率突变率：是指每代细胞发生突变的百分率，是评估遗传标记稳定性与亲子鉴定可靠性的指标。不同基因座的突变率是不同的，一般而言，表达产物水平遗传标记突变率要比DNA遗传标记突变率低。2 2、STRSTR基因座的突变基因座的突变 STR基因座是目前最常用的亲子鉴定遗传标记。STR突变使亲子鉴定面临错判的风险。因此，必须对STR基因座的突变有所认识。复制滑动突变复制滑动突变 复制滑动是形成STR多态性的原因之一，也是STR基因座基因突变的主要原因。表现：a.一步突变。等位基因增加一个或减少一个基序，只涉及一个基序的增加或减少，大约占STR基因座突变的90。b.多步突变。突变基因涉及几个基序。常用STR基因座的突变率大约在0.1%0.5。无效等位基因无效等位基因 如果单个碱基变异正好出现在模板上引物3末端的结合处，将会直接影响该引物退火和延伸，导致这个等位基因没有扩增产物，杂合子个体只有一个等位基因的扩增产物。这个没有扩增产物而漏捡的基因叫做无效基因。常规使用的STR基因座进行观察，无效基因的出现率大约为0.01%0.5%。*蔡颖,周广彪,赵书民 等.中国人群亲权鉴定常用 STR 基因座平均突变率的估计J.中国司法鉴定,2010,5(52):56-59.3 3、防止错误否定父权的方法、防止错误否定父权的方法 由于突变或其他因素的存在，国际上对亲子鉴定的排除提出一些建议，主要是：、只有一个遗传标记不符合遗传规律，不能轻易作出排除结论，必须加测其他系统。、2个STR基因座或同一染色体上的两个遗传标记不符合遗传规律，需慎重对待，宜加测遗传标记后再具体分析。、有3个及以上独立遗传关系（非连锁）的遗传标记不符合遗传规律，则可作出排除亲子关系的结论。、如果只检测STR基因座，一般需检测16个以上。肯定肯定父权的机会父权的机会 在亲子鉴定中，当不能排除受检者与孩子有父子或母子关系，则倾向于认同受检者与孩子有亲子关系。此时需要评价假设父与孩子有亲生关系可能性大小（即亲权机会），以判定是否具有亲生关系。常用评价亲权机会的指标有：父权指数（PI）、似然比率（LR）和父权相对机会。一、父权一、父权指数（指数（PI）父权指数(PI)是判断亲子关系所需的两个概率的似然比，即具有AF遗传表型的男子是孩子生物学父亲的概率(X)与随机男子是孩子生物学父亲的概率(Y)的比值。即PI代表AF具备生父基因成为孩子生父的概率比随机男子具备生父基因成为生父的概率大多少倍。X：具有AF遗传表型的男子是孩子生物学父亲的概率c：AF提供生父基因概率f：生母提供基因概率 Y：随机男子是孩子生物学父亲的概率g：随机男子提供生父基因概率f：生母提供基因概率 计算公式：*杨庆恩.亲子鉴定 D N A 分型亲权指数的简化计算法J.中国法医学杂志;1998,13(2):90-92.二、似然二、似然比率（比率（LR）似然比率（LR）是另一个用于评价亲子关系的名词。以分型结果不违反遗传规律作为条件，假设父是孩子生父的事件概率与一个随机男人是孩子生父的事件概率之比为似然比。父权指数和似然比是同一慨念，只是表达方式的区别，都包含了确定亲子关系的所有信息，是一项重要的亲子关系参数。三、父权相对三、父权相对机会机会(RCP)PI是实数，由这个数字不易看出父权的机会，通常将PI值换算成换算成一个条件概率即父权相对机会（RCP）。父权相对机会既是亲子关系概率，也代表了判断AF是孩子生父的把握度大小。=123 计算公式：CPI：多个遗传标记用于亲子鉴定时，若父权不能否定，由每一个遗传标记获得的父权指数需单独计算。设每个遗传标记的父权指数分别为PI1，PI2，PI3，Pin。n个遗传标记的父权指数相乘则为累积父权指数。亲子亲子鉴定方案鉴定方案一、一、标准的三联体亲子鉴定标准的三联体亲子鉴定 由于母子关系已确定,需要鉴定假设父亲与孩子之间是否存在生物学亲子关系,可以用常染色体标记。比对母子的遗传标记,找出孩子的生父基因：当假设父不具有生父基因,则可排除他与孩子的生物学父子关系;当假设父具有生父基因,则可能为生父,通过计算父权指数或父权相对机会对其为生父可能性的大小作出定量的估计,根据实验室评估标准,确定是否存在父子关系。二、二、女女-子子-男三联体亲子鉴定男三联体亲子鉴定 由于父母与子女关系均不确定，需要鉴定父母双方与孩子的亲生关系，可以用常染色体标记。比对孩子与假设父、假设母的遗传标记：若孩子具有假设父、假设母所缺乏的基 因，则排除他们之间有亲生关系;若孩子的基因可分别从假设父、假设母得到,则他们之间可能有亲生关系。根据双亲不定的模式计算出 PI 和 RCP 值,作出定量评估判定亲生关系。三、三、单亲亲子鉴定单亲亲子鉴定 1、常染色体上标记，比较假设父(或假设母)与孩子的基因型：如果假设父(或假设母)的一对等位基因与孩子的一对等位基因完全不同，则可排除他们之间有亲生关系；假设父(或假设母)与孩子有相同基因时，他们之间可能有亲生关系，按单亲模式计算出 PI 和 RCP 值,作出定量评估,判定亲生关系。2、如果是鉴定母子(女)关系，可以采用母系遗传的线粒体 DNA 分析：如果两者分型不同，可以直接排除;如果相同，不能排除，它们之间可能有亲生关系，计算单倍型频率，是否达到认定水平。3、如果是鉴定父子关系，可以采用父系遗传的 Y-STR 分析：如果两者分型不同，可以直接排除，如果相同，不能排除它们之间可能有亲生关系，计算单倍型频率，是否达到认定水平。四、四、隔代、同胞、旁系亲属间的亲子鉴定隔代、同胞、旁系亲属间的亲子鉴定 由于某种原因(如死亡)，被假设的父亲不能参加检验，而由假设父的亲属参加检验。或者父或/和母已亡，或因某种原因不能参与检验，如为了认亲、移民、继承财产、入户等，要求进行隔代、同胞或叔侄、姨甥等旁系人员间的亲权鉴定。此时，情况将变得复杂些。这类血缘关系鉴定要作出排除结论,利用 Y-STR 和mtDNA 检测较具有优势,可以非常简单排除非亲缘关系。亲子鉴定标准一、排除父权的标准1、经标准化实验检测遗传标记，假定为父亲的男子不能提供给孩子必需的等位基因，在不存在遗传变异的前提下，可以排除假定父亲的父权。即可以断定他不是小孩的生物学父亲。2、为了避免潜在遗传变异影响，排除父权至少应根据两个以上遗传标记。任何情况下都不能仅根据一个遗传标记排除父权。3、目前常用的STR较蛋白质遗传标记有相对更高的突变率，仅仅依靠STR排除父权时，需要更多STR基因座。二、认定父权的标准 经标准化实验检测遗传标记，假定为父亲的男子不能被排除父权。计算概率后如同时满足下列两项指标，可以认定假定父亲的父权，即可以断定他是小孩的生物学父亲。1、实验检测遗传标记的累积非父排除率等于或大于99.95；2、假定父亲的累计父权指数等于或大于2000，即在前概率相同的条件下，假定父亲的相对父权机会等于或大于99.95。什么是什么是STRSTR？STR是短串联重复序列（short tandem repeat）的简称,又称简单重复序列SSR，或微卫星DNA(micro-satellite)。STR是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，它由2-6 bp的核心序列组成，通常重复15-60 次，片段大小一般为100-300 bp。STR主要由于核心序列的重复次数不同而具有高度多态性，是个体的特征，遵循孟德尔共显性遗传规律传递,绝大多数不受选择压力的影响，且较均匀地分布人类全基因组。亲子鉴定实验：亲子鉴定实验：PCR-STRPCR-STRTCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAGACAGGTGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATCATTGAAAGACAAAACAGAGATGGATGATAGATACATGCTTACAGATGCACAC 靶区域靶区域(short tandem repeat)7 repeats8 repeats9 repeats10 repeats11 repeats12 repeats13 repeats核心串联重复次数存在个体差异性核心串联重复次数存在个体差异性等位基因等位基因核心序列核心序列7GATA78GATA89GATA910GATA1011GATA1112GATA1213GATA13优点：优点：1、模板DNA片段短，扩增效率高，灵敏度高；2、检材量少，仅需15ng的模板DNA；3、可使用快速的制备模板DNA；4、扩增结果易于分析，不需要放射性标记；5、可检测部分降解或陈旧性的生物材料，尤其适于检测血痕、精液斑、唾液、毛发、指甲、骨骼等；6、个人识别机率和非父的排除率高。鉴定的鉴定的原理原理 不同个体中，STR核心序列的重复次数不同。根据子代的两条DNA一条来自于父方一条来自于母方，其子代某一特定DNA分子上STR核心序列重复次数必定与父母相同。根据微卫星DNA两端序列的保守性，设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，以检测、分析微卫星序列多态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成功鉴定的目的。理想的理想的STRSTR基因座基因座 从实用价值考虑，用于法医DNA分型的理想STR基因座应具备以下特点：等位基因片段长度在95bp-5OObp范围，最好在400bp以下；具有较高的杂合度及个人识别能力，一般杂合度在0.70以上，DP0.90；具有规律的四核苷酸或五核苷酸重复序列，阴影带出现率较低，较少或没有插入等位基因；等位基因数为1012个，等位基因易于区分；突变率低，不超过0.2；具有高度种属特异性。以上述原则为依据，美国联邦调查局(FBI)推荐用于建设国家DNA 数据库(combined DNA index system，C0DIS)的13个STR 基因座，作为PCRSTR 的常用检测基因座，也成为目前法医STR分型的基础位点。即D3S1358、THO1、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、VWA、D8S1179、TPOX、FGA.Goldeneye-20A试剂盒(北京基点认识技术有限公司)*周保成,许天龙,毛华芬.19个STR基因座分型在741例亲子鉴定中的应用.中国法医学杂志,2015,30(4):396-398.PowerPlex 16 system(Promega,USA)for fifteen STR loci(D31358 et al.)STRtyper1-10F/G system(Condon,China)for another nine STR loci(D18S1364 et al.)大多数的突变是单突变，少数是双突变，极少数是三突变。父亲的突变率和母亲的比是：3.66：1.除了三突变外，累积父权指数（CPI）大于10000.*H.X.Li a,D.Y.Tong a,H.L.Lu etc.Mutation analysis of 24 autosomal STR loci using in paternity testing.Forensic Science International:Genetics Supplement Series 3,2011:e159e160.DNADNA测序测序法法材料处理 经过处理破坏细胞膜以释放细胞内容物将细胞中的DNA释放到提取缓冲液中（尽量确保DNA的完整性）分离纯化（去除杂质包括大量的RNA、蛋白质、多糖和色素等）S ST TR R（Simple Sequence RepeatSimple Sequence Repeat）引物引物设计设计PCR扩增PCR扩增变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C比对示意图通过基因分析仪进行分析，并通过软件读取结果生产过程上机检测测序反应PCR产物纯化PCR反应测序模版质控电泳检测 电泳分离片段后，通过放射自显影技术检测单链DNA片段的放射性带，就可以直接读出DNA的核苷酸序列。如果小孩的遗传位点和被测试男子的位点超过3个不一致，那么该男子便100被排除血缘关系之外，即他绝对不可能是孩子的父亲。如果孩子与其父母亲的位点都吻合，我们就能得出亲权关系大于9999的可能性，即证明他们之间的血缘亲子关系。若若有有12个位点不同，要考虑是否个位点不同，要考虑是否发生了基因突变，这是要对多个发生了基因突变，这是要对多个STR序列位点进序列位点进行鉴定。行鉴定。结果分析结果分析结果分析结果分析1结果分析结果分析2谢谢！