原核表达调控2-分子生物学.pptx
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1、 4 4.色氨酸操纵子色氨酸操纵子(trptrp operon)operon)trp体系参与生物合成,它不受葡萄糖或cAMP-CRP的调控。色氨酸合成主要分5步完成,有7个基因参与整个合成过程。操纵子中各基因功能:trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶,trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶,trpF编码异构酶,trpC编码吲哚甘油磷酸合酶,trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。在许多细菌中,trpE和trpG,trpA和trpB分别融合成一个基因,产生具有双重功能的蛋白质。分支酸先在邻氨基苯甲酸合成酶作用下生成邻氨基苯甲酸,此后先与磷酸核糖焦磷酸中的磷酸核糖形成磷酸核糖邻氨基苯甲酸
2、,经重排、脱羧和关环形成吲哚甘油磷酸,然后在色氨酸合成酶催化下先脱去3-磷酸甘油醛生成吲哚,最后吲哚与一个丝氨酸缩合形成色氨酸。E.Coli中trp操纵子的结构 5个色氨酸合成代谢相关酶的基因构成一个操纵子。合成Trp所需要酶类的5个基因E、D、C、B、A头尾相接串连排列组成结构基因群;受其上游的启动子P和操纵子O的调控。这些基因只有在缺乏Trp时,才被有效表达。trptrp操纵子操纵子 基因基因产产物是物是5个个酶酶,分,分别别是是邻邻氨基苯甲酸合成氨基苯甲酸合成酶酶(E)、邻邻氨基氨基苯甲酸磷酸核糖苯甲酸磷酸核糖转转移移酶酶(D)、磷酸核糖、磷酸核糖邻邻氨基苯甲酸异构氨基苯甲酸异构酶酶-吲
3、哚吲哚甘油磷酸合成甘油磷酸合成酶酶(C)、色氨酸合成色氨酸合成酶酶(B)和色氨酸合成和色氨酸合成酶酶(A)。色氨酸操纵元的调控机制 trp操纵元属阻遏型操纵元,主要调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。色氨酸操纵子通常处于开放状态,其辅阻遏蛋白不能与操纵基因结合而阻遏转录。而当色氨酸合成过多时,色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白,后者与操纵基因结合而使基因转录关闭。4.1辅阻遏蛋白的负调控与lac操纵子的调控不同的是,控制trp操纵子的阻遏蛋白的效应物(Trp)不是一个诱导物(inducer),而是一个辅阻遏物(corepressor)。也就是说,trp操纵子的调节基因
4、的产物(阻遏物蛋白)无活性,不能与操纵基因结合;当Trp存在时,它与阻遏物蛋白结合,诱导该蛋白构象变化,能够结合在操纵基因上并阻止转录。调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群,在其自身的启动子作用下,以组成型方式低水平表达调控蛋白R,R并无活性。当提供足够的Trp时,Trp与R结合使其构象改变而成为活性形式R,R可与操纵基因O特异性结合,阻遏结构基因的转录,R的阻遏能力仅为lac I产物的1/1000。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR,该基因距trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上25分钟处,而前者则位于95分钟处。在位于65分钟处还有一个trpS(色氨酸tRNA合成酶),
5、它与携带有色氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用。大肠杆菌基因组定位是根据在接合过程中染色体转移时间确定的。在接合过程中大肠杆菌基因组全部转移需要100分钟,不同的基因位点位于不同的时间点上。trpRtrpS(色氨酰tRNA合成酶)trpa当有足够的Trp时,操纵子自动关闭。细菌直接利用外界的Trp。缺乏Trp时,trp操纵子被打开,5个结构基因表达,产生3个酶催化分支酸合成为Trp。这是一种负性调控,操纵子通常是开放转录的。当有效应物(Trp)作用时,诱导使阻遏蛋白R构象发生变化,能够结合于操纵基因,则阻遏转录。4.2色氨酸操纵子的衰减调控研究表明色氨酸操纵子存在两种机制的调控
6、。如果trp操纵子只受trpR编码的阻遏物调控,那么在缺乏或存在色氨酸时,trpR突变使trp操纵子表达的酶量应该是相同的。可是,在trpR缺失突变体中,培养基中缺乏色氨酸比有色氨酸存在时操纵子的表达水平更高,说明色氨酸操纵子除受阻遏物调控外,还受另一机制的调控。4.2.1 弱化子与前导肽当阻遏物对trp操纵子的阻遏作用被解除,但细胞内仍有一定浓度的色氨酸时,第二种调控机制使trp操纵子的转录在抵达trpE之前被提前终止,这种现象称为弱化作用(attenuation),DNA中导致mRNA合成提前终止的一段序列称为弱化子(attenuator)。弱化作用产生的关键在于trp mRNA的前导区。
7、在trp操纵子pTrp-O与trpE间有一段162bp的先导序列(leading sequence,L)。在L内有一段123150bp的序列,它在转录起始后可调控转录过程的进行。这段碱基序列如果缺失,trp基因表达可提高6-10倍。mRNA合成起始以后,除非培养基中完全没有色氨酸,转录总是在这个区域终止,产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子,终止trp基因转录。这个区域被称为弱化子,该区mRNA可通过自我配对形成茎-环结构。弱化子的共同特点是某些外部因素控制着弱化子的发夹形成,即形成终止子结构。弱化子为结构基因的转录设了一道关卡。前导肽分析前导序列发现,它包括起始密码子AUG和终止密码子UG
8、A,能产生一个含有14个氨基酸的多肽,这个假设的多肽被称为前导肽。在前导序列的第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。组氨酸操纵子含有7个相邻的组氨酸密码子,苯丙氨酸操纵子也有7个苯丙氨酸密码子,这些密码子参与了操纵子中的转录弱化机制。先导序列包括起始密码子AUG和终止密码子UGA,它编码了一个14个AA的先导肽。编码先导肽的第10、11位是相邻的两个Trp密码子。先导序列含有3对反向重复序列(A=1+2;B=2+3;C=3+4)。如果B(2+3)形成发夹结构,A和C都不能再形成发夹结构。AC当A(1+2)形成发夹结构时,B就不能形成发夹结构,却有利于C(3+4)生成发夹结构。BC后是po
9、ly(U),即C实际是一个终止子,如果转录mRNA时它形成发夹结构,就能使RNA聚合酶停止转录而从mRNA上脱离下来。mRNA前导区的序列分析trp前导区的碱基序列已经全部测定,引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对,有时以1-2和3-4配对,有时只以2-3方式互补配对。终终止止构构型型抗抗终终止止构构型型无色氨酸时操纵子基因开始转录,此后转录速率受转录弱化机制(attenuation)调节。在结构基因与 O 之间有一衰减子区域,该区域含有4段特殊的序列,高浓度色氨酸时能形成不依赖因子的转录终止信号,RNA聚合酶脱落,转录终止。低浓度色氨酸时则不能形成
10、转录终止信号,转录继续。4.2.2弱化子的负调控原核生物转录和翻译几乎同时进行,在Trp未达到能起阻遏作用的浓度时,从Ptrp起始转录,RNA聚合酶沿DNA转录合成mRNA,同时核糖体结合在mRNA上开始翻译。当Trp水平高时,已经起始了转录的RNA聚合酶在特定的位点暂停,接着在到达trp E之前终止。但当Trp缺乏时,聚合酶不终止,而是通读trp基因。Trp合成酶类的量与Trp浓度呈负相关,这种调控现象与Trp操纵子特殊的结构有关。Trp浓度低时,生成Trp-tRNAtrp量少,使核糖体停止在mRNA上的Trp密码子UGG处;使A(1与2)不能形成发夹结构;而2+3形成发夹结构,阻止了3+4
11、生成终止子;RNApol可沿DNA继续转录,trp操纵子就处于开放状态。Trp浓度高时,trp-tRNAtrp浓度随之升高,核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前就到达2区,使2+3不能配对,而3+4区可以自由配对形成茎-环状终止子结构,转录停止,结构基因被关闭而不再合成色氨酸。Trp的存在对终止转录是有效的,弱化子仅允许约10%的RNA聚合酶通过。缺乏Trp时,弱化子允许所有的聚合酶通过。当所有的氨基酸都不足时,核糖体翻译移动的速度就更慢,甚至不能占据A的序列,结果有利于1+2和3+4发夹结构的形成,于是RNApol停止转录。色氨酸操纵子代表了一种衰减调控模式在trp操纵子
12、上,弱化子的转录终止作用取决于色氨酸的浓度。a.高色氨酸条件下,序列3和4配对,形成转录终止发夹。b.低色氨酸条件下,核糖体停在色氨酸密码子附近,序列1被核糖体覆盖,序列2和3配对,因此阻止了3、4之间形成转录终止发夹。c 没有蛋白合成时,如果没有核糖体起始先导肽的翻译,序列1、2形成发夹,阻止了2、3发夹的形成,允许序列3、4形成转录终止发夹,酶不表达。实验证实验证据据转录转录弱化理弱化理论论得到了大量得到了大量实验证实验证据的支持:(据的支持:(1)影响区段)影响区段3和区段和区段4二二级结级结构构稳稳定性的突定性的突变变以及改以及改变变区段区段4后面一串后面一串U的突的突变变都会降低弱化
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