EGFR_ERK_MMP-2通路调控牙龈纤维化的初步研究.pdf
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1、北京口腔医学 2024年第32卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2024,Vol.32,No.121遗传性牙龈纤维瘤病(hereditary gingival fibromatosis,HGF)是一种罕见的全口牙龈弥漫性纤维增生病变,增生部分可达牙冠甚至咬合面,影响咀嚼、语言、美观以及口齿闭合,形成牙间隙诱发牙齿畸形1。目前治疗 HGF 的方法为手术切除增生治疗,但术后易出现复发2。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)其激活与多种癌前病变关系密切,且其过表达与肿瘤转移密切相关3,已
2、经成为肿瘤基因治疗的靶位点4。EGFR/ERK/MMP-2 通路调控牙龈纤维化的初步研究张晓红 李生婷 常群安【摘要】目的 探讨表皮生长因子受体/细胞外信号调节激酶/基质金属蛋白酶-2(EGFR/ERK/MMP-2)通路调控牙龈纤维化的作用机制。方法 收集本院 4 例因畸形治疗的健康者和 4 例遗传性牙龈纤维瘤病(HGF)患者牙龈组织标本;苏木素-伊红(HE)染色检测牙龈组织的组织学变化情况;蛋白质免疫印迹检测牙龈组织中 EGFR 蛋白表达情况。体外培养人牙龈成纤维细胞(HGFs),并分为对照组、EGFR 激动剂组、EGFR 抑制剂组,EGFR 激动剂组添加终浓度为 10 ng/ml EGF,
3、EGFR 抑制剂组添加终浓度为 10 mol/L AG1478,对照组添加10%胎牛血清的 DMEM 培养液培养细胞,处理 48 h 后,蛋白质免疫印迹检测细胞中 EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2 蛋白水平;CCK-8 法检测细胞增殖情况。结果 HGF 患者牙龈组织充满粗大的胶原纤维和成纤维细胞,血管偏少,结缔组织处出现轻微炎症。与健康者相比,HGF 患者牙龈组织中 EGFR 蛋白水平升高(P 0.05)。在细胞实验中,与对照组相比,EGFR 激动剂组细胞中 EGFR、p-ERK1/2/ERK1/2、MMP-2 蛋白水平及细胞增殖率升高(P0.05),EGFR 抑制剂组细胞
4、中 EGFR、p-ERK1/2/ERK1/2、MMP-2 蛋白水平及细胞增殖率降低(P0.05)。结论 EGFR/ERK/MMP-2 通路可能通过促进细胞增殖加强牙龈纤维化进程,抑制 EGFR 的表达从而缓解疾病。【关键词】EGFR/ERK/MMP-2 通路;牙龈纤维化;遗传性牙龈纤维瘤病【中图号】R780.2【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2024.01.005Preliminary study on regulation of gingival fibrosis by EGFR/ERK/MMP-2 pathway ZHANG Xiao-ho
5、ng,LI Sheng-ting,CHANG Qun-an.Department of Stomatology,Qinghai Womens and Childrens Hospital,Xining 810006,China【Abstract】Objective To investigate the mechanism of epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/matrix metalloproteinase-2(EGFR/ERK/MMP-2)pathway regulating gin
6、gival fibrosis.Methods The gingival tissue samples from 4 healthy people and 4 patients with hereditary gingival fibromatosis(HGF)were collected.Hematoxylin-eosin(HE)staining was used to detect the histological changes of the gingival tissues.Western blot was used to detect EGFR protein expression i
7、n gingival tissue.Human gingival fibroblasts(HGFs)were cultured in vitro and divided into control group,EGFR agonist group,and EGFR inhibitor group.The EGFR agonist group was supplemented with a final concentration of 10 ng/ml EGF and EGFR inhibitor group was supplemented with a final concentration
8、of 10 mol/L,the cells in the control group were cultured in DMEM medium with 10%fetal bovine serum.After 48 h treatment,the protein levels of EGFR,ERK1/2,p-ERK1/2 and MMP-2 were examined by Western blot.CCK-8 method was use to detect cell proliferation.Results The gingival tissue of HGF patients was
9、 full of thick collagen fibers and fibroblasts,and there were few blood vessels,and there was slight inflammation in the connective tissue.Compared with healthy people,the EGFR protein level in the gingival tissue of HGF patients increased(P0.05).Compared with the control group,the EGFR,p-ERK1/2/ERK
10、1/2,MMP-2 protein levels and cell proliferation rate in the EGFR agonist group increased(P0.05),and EGFR,p-ERK1/2/ERK1/2,MMP-2 protein levels and cell proliferation rate in the EGFR inhibitor group decreased(P0.05).Conclusions The EGFR/ERK/MMP-2 pathway may enhance the gingival fibrosis process by p
11、romoting cell proliferation,while inhibiting the expression of EGFR.【Key words】GFR/ERK/MMP-2 pathway;Gingival fibrosis;Hereditary gingival fibromatosis基金项目:青海省科技计划项目(2020-SF-131)作者单位:810006 西宁 青海省妇女儿童医院口腔科(张晓红);青海省第五人民医院口腔科(李生婷);青海大学附属医院口腔颌面外科(常群安)通信作者:常群安,E-mail:,电话:0917-8179434北京口腔医学 2024年第32卷第1期
12、Beijing Journal of Stomatology February 2024,Vol.32,No.122EGFR 调控不同肿瘤的转移与细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)关系密切,ERK 又能调控基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的表达5,6。研究发现 HGF 患者牙龈上皮乳头尖的 EGF 或 EGFR 表达明显升高,增殖细胞数量增加,说明 EGFR 通过影响增殖参与 HGF 进展7。MMP-2,又名明胶酶A,是牙龈组织降解的关键媒介8,可被人龈沟液中的牙龈假单胞
13、菌和人牙周韧带成纤维细胞中的齿状假单胞菌激活9,10。最新研究显示,MMP-2 在HGF 患者中的表达高于健康对照者11。但目前尚未发现 EGFR/ERK/MMP-2 通路在 HGF 中的作用机制。本研究以 HGF 患者牙龈组织为研究对象,探讨 EGFR 的表达情况,并以此为基础,观察 EGFR/ERK/MMP-2 通路对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)的影响,为 HGF 的治疗提供一定参考。资料和方法1.组织来源及细胞来源收集本院来自 1630 岁的 4 例因正畸治疗的健康者拔牙部分的牙龈组织标本,4 例 HGF 患者牙龈组织标本。所有研究对
14、象或其直系亲属签署知情同意书,且经本院伦理委员会批准后实施。细胞来源:HGFs 购自北纳生物(编号:BNCC339845)。2.试剂与仪器苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司,货号:C0105);EGFR 激动剂表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)(上海硕盟生物科技有限公司,货号:075613);EGFR 抑制剂 AG1478(上海陶素生化科技有限公司,货号:T2047);一抗 EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2(英国 abcam 公司,货号分别为:ab52894、ab184699、a
15、b223500、ab92536);蛋白裂解液(北京索莱宝生物科技有限公司,货号:R0020);DAB 显色试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司,货号:SNM427-OYA);蛋白凝胶成像仪(上海 Tanon 公司,型号:Tanon-4800)。3.实验方法HE 染色检测牙龈组织的组织学变化:新鲜牙龈组织经 4%多聚甲醛固定,经脱水、包埋、石蜡切片(厚度:6 m),脱蜡、水化、苏木素染色、盐酸酒精分化、冲洗返蓝,伊红复染,脱水、透明、封片,显微镜下观察。蛋白质免疫印迹(western blot,WB)检测牙龈组织中 EGFR 蛋白表达:健康者的牙龈组织和 HGF患者牙龈组织经手术剪剪碎,添加蛋白裂解
16、液冰上裂解 20 min,4 12000 r/min 离心 20 min。BCA 法对蛋白定量分析,每孔上样 20 ng,经 PAGE 胶分离、PVDF 膜转膜后,5%脱脂奶粉室温封闭 2 h,添加一抗 EGFR,4孵育过夜;次日去除一抗后清洗,添加对应二抗,室温孵育 1 h。DAB 显色试剂显色,蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。HGFs 细胞分组:将细胞分为对照组、EGFR激动剂组、EGFR 抑制剂组。将细胞培养至对数生长期,2104个/ml 接种至 6 孔板中,每孔 2 ml,37、CO2培养箱中培养细胞,细胞贴壁时 EGFR激动剂组添加终浓度为 10 ng/ml EGF,EGFR 抑制剂组
17、添加终浓度为 10 mol/L AG1478,对照组 10%胎牛血清的 DMEM 培养液培养细胞,分别处理细胞 24、48、72 h,显微镜下观察细胞生长状态,细胞处理 48 h 进行后续实验研究。WB检测细胞中EGFR蛋白水平:细胞培养48 h,吸取培养液,添加消化液消化细胞,收集细胞至离心管中,1000 r/min 离心 5 min,弃上清,加入预冷的蛋白裂解液冰上裂解 30 min。12000 r/min 4离心 20 min,上层为总蛋白。按牙龈组织 EGFR 蛋白表达检测方法检测细胞中 EGFR 蛋白表达水平。CCK-8 法检测细胞增殖情况:HGFs 稀释成2104个/ml,每孔 1
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