用于重组蛋白药物生产的CHO细胞基因改造技术研究进展.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 收稿日期：2023 年 12 月 21 日 作者简介：牛梦雅(1990),女,汉族,河北徐水人,工程师,硕士研究生,研究方向为重组蛋白药物开发及动物细胞培养技术。-201-用于重组蛋白药物生产的CHO细胞基因改造技术研究进展 牛梦雅 华北制药金坦生物技术股份有限公司，河北 石家庄 050035 摘要：摘要：细胞系的选择和优化是生物制品制造环节中非常关键的一步。其中 CHO 细胞是最常用的宿主细胞。CHO 细胞源于中国仓鼠卵巢细胞，具有许多优势，如易于培养、具有较高的蛋白表达能力以及良好的糖基化修饰等。这些特点使得 CHO 细胞成为重组蛋白药物生产的理想候选。尽管 CHO 细胞已经实现在商业产生产重组蛋白类药物的广泛应用，但仍存在代谢途径难以调控、细胞株表达水平不稳定、表达蛋白的质量控制困难等问题。因此，科研人员不断致力于利用基因工程技术对 CHO 细胞进行改造，提高目的基因表达效率，进而优化重组蛋白生产工艺。本文对利用细胞工程技术改造 CHO 细胞用于重组蛋白药物生产进行了系统的研究，详细阐述了细胞工程技术在CHO 细胞改造中的原理和方法，最后对未来潜在的发展方向进行了预测和展望。关键词：关键词：CHO 细胞；细胞工程改造；重组蛋白药物生产 中图分类号：中图分类号：R392 重组蛋白药物是应用重组 DNA 技术合成的具有生物学活性的蛋白类药物，目前常见的种类有多肽类激素、细胞因子、重组酶类等，广泛应用于肿瘤治疗、基因治疗、免疫治疗、神经调节等领域。中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）因具有与人体类似的翻译后修饰、几乎不分泌内源性蛋白、清晰的历史背景和监管机构的认可、能够实现大规模悬浮培养等优势，被人们所熟知。CHO 细胞的应用不仅限于重组蛋白药物的表达，还包括病毒疫苗制备、基因治疗等其他方面的应用。对于CHO细胞上游技术的应用，构建高产量稳定表达的细胞株与合适的培养条件至关重要。一般而言，合适的培养条件包括培养基的筛选、补充营养物质的添加、适宜的培养温度和合理的培养容器等，这些条件直接影响 CHO 细胞的生长和蛋白表达能力。其次，细胞工程技术的发展为 CHO 细胞的改造提供了可行性。例如，通过基因敲除、基因编辑、基因过表达等手段，可以改变 CHO 细胞的代谢途径、提高蛋白的表达水平、改善糖基化修饰等，从而进一步改善 CHO 细胞应用于重组蛋白药物生产的不足。1 CHO 细胞表达系统存在的问题 虽然重组 CHO 细胞表达系统在生物制药领域的应用已经占据了一壁江山，但在工业化过程实施中也体现出一些问题。比如，与原核表达系统相比，细胞对于培养条件要求更高、培养耗时更长、蛋白表达量偏低等。其中，一直困扰着行业的难点在于如何解决生产过程中 CHO 细胞的不稳定性导致的细胞表达水平及产品质量不断下降的问题。通常认为稳定的细胞系应在 60 代及以上群体倍增时间中生产产量保持在 70%以上，且产品结构、功能、纯度、理化性质等方面没有显著变化1。据估计，8-63%的重组 CHO 细胞系存在细胞株产物滴度不稳定的现象。早期产量不稳定可能归因于表观遗传机制导致的转基因表达丧失，而逐渐产生的不稳定性可能与传代过程中不表达的亚群有关。可能原因包括 CHO 细胞基因组自带的不稳定性及外源基因随机整合在细胞基因组的不确定性。CHO 细胞基因组的固有不稳定性主要是指 CHO 野生株细胞自分离便在大部分亚克隆细胞内发生了不同程度的染色体重排现象，除此之外，还有由于转录错误导致的 DNA 模板变异现象。这些因素会导致经转染得到的生产细胞系基因不稳定性。外源基因随机整合带来的不稳定性表现在外源基因随机整合在 CHO 细胞基因组时发生位置效应，随着多拷贝插入和外源基因扩增，为了消除表达重组蛋白带来的代谢负担，宿主细胞倾向于自发消除转基因，导致拷贝数丢失，表现出来重组蛋白表达的不稳定性。此外，其他导致外源蛋白表达不稳定的因素包括转基因沉默、染色质重构、表观遗传学及表型漂移、宿主细胞蛋白质组学及代谢组学的改变等2。2 重组 CHO 细胞株的构建方法 一般重组 CHO 细胞株构建方法是将质粒以转染的中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-202-方式整合到宿主细胞的基因组，然后利用筛选标记进行压力筛选获得单克隆细胞池（pool）。常用的筛选标记基因有抗生素类、代谢缺陷型类如 DHFR 基因和 GS基因。由于每个细胞群表达量不一致，需要通过有限稀释法、流式细胞荧光分选技术、高通量细胞克隆筛选系统进行单克隆筛选。对得到的高产量单克隆进行扩大培养及工艺开发，同时进行稳定性测试，确保生长、表达状态保持稳定后才能进行细胞建库和工艺优化。以传统随机整合法构建稳定高产的重组细胞株通常至少需要 12 个月左右的时间。基因编辑技术的进步为缩短 CHO 细胞系开发用时及简化操作提供了卓有成效的思路。基因编辑技术能够实现对基因组中特定基因进行精准修饰。这个技术依赖于“分子剪刀”核酸酶（Nucleases），可以使基因组锚定位点的 DNA 双链断裂，诱导生物体通过非同源末端连接或同源定向修复的方式来修补 DNA 缺口3。3 利用细胞工程技术改造CHO 细胞的实际应用 3.1 基因编辑技术 基因编辑技术可以利用核酸内切酶，精确识别靶点基因序列，对其进行切割，完成特定 DNA 插入、突变、敲除，从而完成对靶点基因的精确编辑。基因编辑的关键是在靶点基因形成 DNA 双链断裂，目前常用的基因编辑技术有锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）技 术、转 录 激 活 样 效 应 因 子 核 酸 酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术和 CRISPR/相关蛋白（CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas）系统4。ZFNs 被称为第一代基因编辑技术。由 ZFP（锌指蛋白）和 Fok 内切酶的 DNA 识别域和 DNA 剪切域构成。ZFP 能识别特定的 3 个连续碱基对，Fok 内切酶发挥切割作用。Fok 内切酶通过 N 端与 ZFP 连接，构成 1 个 ZFN。2 个 ZFN 单体相互作用，作用位点的 DNA序列长度在 57bp。ZFNs 的出现具有奠基石的意义，不可避免也存在一些问题，如成本高、难以实现多靶点编辑。作为第二代编辑技术的TALENs切割效率更高、特异性更强，其构建也比 ZFNs 容易。但是，TALENs在尺寸上要比 ZFNs 大得多，而且有更多的重复序列，且具有一定细胞毒性。CRISPR/Cas9 系统被称为第三代基因编辑技术人工核酸内切酶，CRISPR-Cas9 依赖于外源 DNA 片段在 CRISPR 序列整合。经过转录及剪切后产生短的 crRNA，crRNA 与反式转录的 crRNA（tracrRNA）退火结合，引导 Cas9 蛋白介导序列特异性的外源 DNA降解。CRISPR-Cas9 系统设计简单、成本较低、效率更高，现已被广泛应用于细胞工程、基因治疗等领域。Lee 等人首先公布了在 CHO-S 细胞中 COSMC、LdhA 和Mgat1 位点进行定点整合的结果5。McVey 等人使用CRISPRCas9 技术成功敲除 CHO 细胞中 TSC2 基因，该基因可抑制 mTORC1（雷帕霉素靶蛋白）活性。改造后的 CHO 细胞株在 fed-batch 培养条件下 mTORC1 活力显著提升，单细胞表达量提高两倍以上，且 TSC2 的敲除并未影响分泌抗体的质量属性6。3.2 RNA 干扰技术 RNA 干扰技术（RNA interference，RNAi）又称转录 后 基 因 沉 默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），是由双链 RNA（dsRNA）诱发的同源 mRNA 高效特异性降解的现象，使目的基因不表达或表达水平下调。RNA 干扰技术主要运用于特异性基因沉默，意在改善细胞凋亡，调节细胞代谢及细胞产量。7 3.3 细胞培养条件的优化 细胞培养条件对于目的蛋白的表达产量和产品质量至关重要。CHO 细胞的生长和重组蛋白的产量高度依赖于细胞培养环境，包括培养基的成分、pH 值、氧气和二氧化碳浓度、温度等。为了达到较高的重组蛋白产量，研究人员通常会对以上条件进行优化。例如，调整培养基中特定营养物质的浓度，改善细胞的代谢状态，优化理化参数控制等，从而提高细胞的生长速度和重组蛋白的产量。4 利用细胞工程技术改造CHO 细胞的研究进展 4.1 改造 CHO 细胞表达系统 CHO 细胞表达系统的改造主要包括筛选标记基因和表达载体的改造。Sigma-Aldrich 公司利用 ZFNs 技术将 CHO 细胞基因组中谷氨酰胺合成酶（GS）基因和二氢叶酸还原酶（DHFR）基因分别敲除，构建了 CHO/GS-缺陷株和 CHO/DHFR-缺陷株，分别使用蛋氨酸亚氨基代砜（MSX）和甲氨蝶呤（MTX）筛选标记可提高插入基因的拷贝数。筛选标记缺陷型稳定工程细胞株的开发，使得 CHO 细胞在重组蛋白药物生产中得到更广泛的应用。中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-203-质粒作为常用的表达载体，主要有双质粒共转染和单质粒转染两种应用方式，质粒主要组成元件也成为了重点改造对象。例如在不同的启动子强度测试中，发现使用CHEF-1启动子可以让插入基因具有更高的表达效率；CMV 启动子可以使插入基因在细胞长时间培养过程中保持更稳定的表达。根据 CHO 基因组序列设计的合成启动子，可以显著提高 CMV-1E 启动子的转录强度。4.2 改造 CHO 细胞抗凋亡工程 细胞凋亡是为维持内环境稳定，由多个基因控制的细胞自主有序死亡的过程。它涉及到一系列基因的激活、表达及调控作用。在细胞培养过程中一旦面临营养物质匮乏、代谢废物积累和渗透压升高等培养条件的变化，就容易触发细胞凋亡机制。进而对细胞生长状态、表达水平及产物质量造成不利影响。目前对于细胞凋亡的详细作用机理尚不明确，已知受到 Bcl-2蛋白家族（抗凋亡 Bcl-2 样蛋白、促凋亡的 Bax 样蛋白和促凋亡 BH3 蛋白）的调控。所以抗凋亡蛋白的激活和促凋亡因子的抑制对于延缓发生细胞凋亡有着重要的意义。有研究发现将抗凋亡基因 Bcl-xL 与 Mcl-1共转染至 CHO 细胞内可提高细胞活率。过表达 Aven、Faim、XIAP 和 CrmA 等基因能够延长细胞寿命。通过在CHO 细胞中过表达 X-box 结合蛋白(XBP-1(s)以提高细胞抗凋亡水平，使 IgG 的表达量显著提高7。尽管在利用细胞工程技术改造 CHO 细胞方面取得了一定的进展，但仍存在一些挑战和待解决的问题。目前对 CHO 细胞的改造主要集中在提高表达效率和产量稳定性，缺乏对其分泌机制、细胞生存环境等方面的深入研究。其次，目前的细胞工程技术仍有局限性，无法满足对 CHO 细胞更精细调控的需求。因此，在未来的研究中，需要进一步深入探究 CHO 细胞的生物学特性和代谢途径，以及开发新的细胞工程技术，以实现对 CHO 细胞更精准和可控的调控。总之，利用细胞工程技术改造 CHO 细胞是生物制品上游培养技术研究的一个重要方向。尽管目前存在一些挑战和问题，但通过不断的研究和探索，相信可以实现对 CHO 细胞的更精准和高效改造，进一步提高重组蛋白药物的生产效率和质量。参考文献 1Dahodwala H,Lee K H.The fickle CHO:a 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