重组与基因工程.pptx

Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程一、一、DNADNA的重组的分类的重组的分类同源重组、特异位点重组和转座重组等类型同源重组、特异位点重组和转座重组等类型二、自然界的基因转移和重组二、自然界的基因转移和重组 自然界的基因转移和重组是无目的自然界的基因转移和重组是无目的 基因工程有目的基因工程有目的基因重组基因重组(genetic recombination)整段整段DNA在细胞内或细胞间在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进甚至不同物种间进行交换行交换,并能在新的位置上复制并能在新的位置上复制,转录和翻译。转录和翻译。第1页/共23页 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程二、自然界的基因转移和重组二、自然界的基因转移和重组1 1、结合作用、结合作用 结合作用结合作用质粒质粒DNADNA从一个细胞（细菌）转移至另一从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）个细胞（细菌）2 2、转化及转导作用、转化及转导作用 （1 1）转化作用）转化作用 transformationtransformation 通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNADNA，使细胞或培养，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程的受体细胞获得新的遗传表型的过程（2 2）转导作用）转导作用 transductiontransduction 病毒、噬菌体介导病毒、噬菌体介导溶菌途径溶菌途径 溶原菌途径溶原菌途径3 3、转、转 座座第2页/共23页（2 2）转导作用）转导作用 transductiontransduction 病毒、噬菌体介导病毒、噬菌体介导溶菌途径溶菌途径 溶原菌途径溶原菌途径2 2、转化及转导作用、转化及转导作用第3页/共23页3 3、转、转 座座转转 座座 反向重复序列反向重复序列 由可移动的由可移动的DNADNA序列（插入序列和转序列（插入序列和转座子）介导的基因移位或重排座子）介导的基因移位或重排插入序列转座插入序列转座保守性转座保守性转座 复制性转座复制性转座反向重复序列反向重复序列 转座酶转座酶转座子转座转座子转座 转座子转座子可以从一个染色体位点转可以从一个染色体位点转移至另一位点的分散的重复序列移至另一位点的分散的重复序列第4页/共23页 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程二、自然界的基因转移和重组二、自然界的基因转移和重组4 4、基因重组、基因重组不同不同DNA 分子间发生的共价连接称重组分子间发生的共价连接称重组（一）位点特异的重组（一）位点特异的重组 特异位点特异位点（二）同源重组（二）同源重组 同源序列间的重组同源序列间的重组第5页/共23页 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程三、重组三、重组DNA技术技术1973 Cohen1973 Cohen第一例成功的克隆实验第一例成功的克隆实验19781978 Genentech Genentech公司公司 人胰岛素人胰岛素 世界上世界上第一种基因工程蛋白药物第一种基因工程蛋白药物 19821982 第一个基因工程药物第一个基因工程药物-重组人胰岛素在重组人胰岛素在英、美获准使用英、美获准使用 19851985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国中国 转基因鱼转基因鱼 第6页/共23页n19931993 基因工程西红柿在美国上市基因工程西红柿在美国上市n19971997 英国罗斯林研究所英国罗斯林研究所 多莉羊多莉羊n1999.91999.9 中国获准加入人类基因组计划中国获准加入人类基因组计划.负责负责测定人类基因组全部序列的测定人类基因组全部序列的1%1%n2000.6.26 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图科学家公布人类基因组工作草图n2001.2.112001.2.11 公布人类基因组基本信息公布人类基因组基本信息n生物技术工程：生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程程、细胞工程 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程三、重组三、重组DNA技术技术第7页/共23页n胰岛素胰岛素n人生长激素人生长激素n干扰素干扰素n白细胞介素白细胞介素2 2n粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子n粒细胞巨噬细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子n红细胞生成素红细胞生成素 EPOEPOn组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂n生长激素生长激素n促生长素促生长素n抗血友病因子抗血友病因子n脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶n葡糖脑苷脂酶葡糖脑苷脂酶n鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体第8页/共23页 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程三、重组三、重组DNA技术技术（一）重组（一）重组DNA技术的相关概念技术的相关概念1 1、DNADNA克隆克隆克隆（克隆（cloneclone）无性繁殖无性繁殖分子克隆分子克隆(DNA(DNA克隆克隆)应用酶学的方法，在体外将应用酶学的方法，在体外将目的基目的基因因与与载体载体DNADNA结合成一具有自我复制能力的结合成一具有自我复制能力的DNADNA分子分子（复制子、重组体复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一取获得大量同一DNADNA分子拷贝，或其分子拷贝，或其表达产物表达产物。基因克隆、基因克隆、DNADNA重组、重组、基因工程基因工程 (genetic engineering)(genetic engineering)第9页/共23页n基因克隆示意图基因克隆示意图第10页/共23页 2 2、工具酶、工具酶常用的工具酶常用的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶切割切割DNADNA连接酶连接酶生成生成3-5磷酸二酯键磷酸二酯键DNA聚合酶聚合酶探针标记、补平探针标记、补平3末端末端反转录酶反转录酶cDNA合成合成多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记磷酸化、探针标记末端转移酶末端转移酶3末端多聚尾末端多聚尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基（一）重组（一）重组DNA技术的相关概念技术的相关概念第11页/共23页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶细菌限制修饰体系细菌限制修饰体系 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 甲基化酶甲基化酶识别特异的位点识别特异的位点酶切位点酶切位点回文结构回文结构 46 bp出现两种末端出现两种末端粘性末端粘性末端 粘端粘端 平头末端平头末端 平端平端 配伍末端配伍末端（一）重组（一）重组DNA技术的相关概念技术的相关概念第12页/共23页目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）cDNA cDNA 逆转录逆转录基因组基因组DNADNA基因工程的目的基因工程的目的目的基因拷贝目的基因拷贝 克隆载体克隆载体基因表达产物基因表达产物 表达载体表达载体3 3、目的基因、目的基因 target DNAtarget DNA（一）重组（一）重组DNA技术的相关概念技术的相关概念第13页/共23页 自我复制自我复制克隆载体、表达载体克隆载体、表达载体原核载体原核载体：质粒：质粒(pBR322,pUC）噬菌体（）噬菌体（，M13）真核载体真核载体：动物病毒载体：动物病毒载体pLXSN质粒质粒存在于细菌染色体外的小型环状双链存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子 理想的质粒理想的质粒 1.拷贝数多拷贝数多;2.两三个抗药性基因两三个抗药性基因 terr ampr 筛选标志筛选标志3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）合适的限制性内切酶酶切位点（单一）（一）重组（一）重组DNA技术的相关概念技术的相关概念4 4、基因载体、基因载体 vector第14页/共23页第15页/共23页 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程三、重组三、重组DNA技术基本原理技术基本原理（一）目的基因获得（一）目的基因获得1 1、化学合成法、化学合成法2 2、基因组、基因组DNA DNA 基因组基因组DNADNA文库文库存在于转化细菌中、克隆存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组载体携带的所有基因组DNADNA的集合的集合3 3、cDNA cDNA cDNAcDNA文库文库4 4、聚合酶链式反应、聚合酶链式反应 PCRPCR第16页/共23页(二二)克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建(三三)外源基因与载体的连接（外源基因与载体的连接（DNA连接酶）连接酶）连接方式连接方式 1.粘性末端连接粘性末端连接 连接效率高连接效率高 相同酶切末端相同酶切末端 配伍末端配伍末端 2.平端连接平端连接 连接效率低连接效率低 3.同聚物接尾法同聚物接尾法 4.人工接头法人工接头法 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程三、重组三、重组DNA技术基本原理技术基本原理第17页/共23页重组重组DNA技术简图技术简图第18页/共23页(四四)重组重组DNADNA导入受体菌导入受体菌基因工程菌基因工程菌 HB101,JM109HB101,JM109转化转化制备感受态细胞制备感受态细胞 冷的氯化钙处理冷的氯化钙处理细胞处于最适摄取和容忍外来细胞处于最适摄取和容忍外来DNADNA的生理状态的生理状态 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程三、重组三、重组DNA技术基本原理技术基本原理第19页/共23页(五五)重组体的筛选重组体的筛选 screening/selection 1.直接选择法直接选择法 抗药性标志选择抗药性标志选择 标志补救标志补救 表达产物与营养缺陷互补表达产物与营养缺陷互补 互补互补 蓝白斑筛选蓝白斑筛选 分子杂交分子杂交 探针探针原位杂交原位杂交/Southern印迹法印迹法 限制性酶切图谱限制性酶切图谱/PCR 2.非直接选择法非直接选择法 免疫学方法免疫学方法 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程三、重组三、重组DNA技术基本原理技术基本原理第20页/共23页(六六)克隆基因的表达克隆基因的表达 载体有转录、翻译的元件载体有转录、翻译的元件 密码子通用密码子通用1 1、原核表达体系原核表达体系 原核表达载体的标准原核表达载体的标准n合适的筛选标志合适的筛选标志n强启动子强启动子n翻译控制序列翻译控制序列n多克隆位点多克隆位点 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程三、重组三、重组DNA技术基本原理技术基本原理第21页/共23页 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程四、重组四、重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系 分子医学分子医学 molecular medicine（一）疾病基因的发现（一）疾病基因的发现（二）发展生物制药（二）发展生物制药基因工程药物基因工程药物基因工程疫苗基因工程疫苗（三）（三）DNA诊断诊断 基因诊断基因诊断 基因诊断基因诊断用分子生物学的技术对引起疾病用分子生物学的技术对引起疾病的原因的原因-遗传基因遗传基因,致病微生物和寄生虫致病微生物和寄生虫,以及以及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞遗传基因的检测和分析遗传基因的检测和分析.DNA/RNA第22页/共23页 Chapter35 DNADNA的重组与基因工程的重组与基因工程四、重组四、重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系（四）基因治疗（四）基因治疗 gene therapy基因治疗基因治疗就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。疗的目的。1、基因置换、基因置换2、基因修正、基因修正3、基因修饰、基因修饰 产物补偿缺陷细胞产物补偿缺陷细胞4、基因失活、基因失活 反义技术封闭基因反义技术封闭基因,抑制有害基因抑制有害基因对象对象 体细胞体细胞 生殖细胞生殖细胞本章完本章完第23页/共23页