目的基因的获得.pptx
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1、第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得生命科学学院生命科学学院第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得对于高等真核生物而言,于高等真核生物而言,基因基因组DNADNA十分十分庞大大,基因可达基因可达数万个,且基因数万个,且基因组成成结构复构复杂,除,除编码序列序列,还有有非非编码序列序列及及调控序列控序列,基因,基因间还存在大量的存在大量的间隔序列和重复序列,因此,隔序列和重复序列,因此,单个目的基因在整个基因个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小,除少数例中所占的比例极其微小,除少数例外,外,绝大多数基因大多数基因难以直接分离得到。以直接分离得到。为了解决了解决这个个难题,一种可行
2、的方法就是将,一种可行的方法就是将这个基因个基因扩增,增,增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是往往是未知基因未知基因,因此无法,因此无法对它它进行特异性行特异性扩增,而只能增,而只能对所所有的基因有的基因进行行扩增,也就是构建增,也就是构建该生物材料的基因文生物材料的基因文库,然后,然后再根据不同的方法将所需的克隆再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来,最后分离得到目的出来,最后分离得到目的基因。基因。生命科学学院生命科学学院第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得基因文基因文库(gene library)概念概念又
3、称又称DNA文文库,是指某个生物的基因,是指某个生物的基因组DNA或或cDNA片段与适当片段与适当的的载体在体外重体在体外重组后,后,转化宿主化宿主细胞,并通胞,并通过一定的一定的选择机制机制筛选后后得到大量的阳性菌落得到大量的阳性菌落(或噬菌体或噬菌体),所有菌落或噬菌体的集合即,所有菌落或噬菌体的集合即为该生生物的基因文物的基因文库。按外源按外源DNA片段的来源分基因文片段的来源分基因文库分分为:基因基因组DNA文文库从特定从特定组织提取的染色体基因提取的染色体基因组DNAcDNA文文库mRNA反反转录成的成的cDNA拷拷贝基因文基因文库由由外源外源DNA片段片段、载体体和和宿主宿主组成。
4、成。生命科学学院生命科学学院第五章第五章 目的基因的获得目的基因的获得生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(一一)基因基因组DNA文文库的的类型型 根据所根据所选用的用的载体可以分体可以分为:质粒文粒文库噬菌体文噬菌体文库粘粒文粘粒文库人工染色体文人工染色体文库(细菌人工染色体文菌人工染色体文库、酵母人工染色体文、酵母人工染色体文库等)等)载体能够容载的载体能够容载的DNADNA片断大小片断大小直接影响到构建完整的基因文库所直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。需要的重组子的数目。载体系列:载体系列:容量为容量为 24 kp cosmid载体:载体
5、:容量为容量为 50 kb YAC:容量为容量为 1 Mb BAC:容量为容量为 300 kb生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建 用质粒载用质粒载体构建基因组文体构建基因组文库的流程库的流程该法简单、快该法简单、快速、易于操作,但速、易于操作,但仅适合一些低等真仅适合一些低等真核生物和原核生物核生物和原核生物。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用用噬菌体载体构建基因组文库的流程噬菌体载体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用用黏粒黏粒载体构建基因组文库的流程载体构建基因
6、组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用酵母人工染色体构建基因组文库的流程用酵母人工染色体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建用酵母人工染色体构建基因组文库的流程用酵母人工染色体构建基因组文库的流程生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(二二)基因基因组DNA文文库的的质量量标准准一个理想的基因一个理想的基因组DNA文文库应具具备下列条件:下列条件:重重组克隆的克隆的总数不宜数不宜过大,以减大,以
7、减轻筛选工作的工作的压力。力。载体的装体的装载量最好大于基因的量最好大于基因的长度,避免基因被分隔度,避免基因被分隔克隆。克隆。克隆与克隆之克隆与克隆之间必必须存在足存在足够长度的重叠区域,以利度的重叠区域,以利克隆排序。克隆排序。克隆片段易于从克隆片段易于从载体分子上完整卸下。体分子上完整卸下。重重组克隆能克隆能稳定保存、定保存、扩增、增、筛选。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因基因组DNA文文库构建的程序构建的程序 1.1.载体体DNADNA的制的制备;2.2.高高纯度度大大相相对分分子子质量量基基因因组DNADNA的的提提取取和和大大片片段
8、段的的制制备;3.3.高高纯度度大大相相对分分子子质量量基基因因组DNADNA的的部部分分酶切切与与脉脉冲冲电泳分泳分级分离;分离;4.4.载体与外源片段的体与外源片段的连接与接与转化或侵染宿主化或侵染宿主细胞;胞;5.5.重重组克隆的挑克隆的挑选和保存。和保存。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因基因组DNADNA文文库构建的程序构建的程序1载体体DNA片段的制片段的制备 DNA分离分离纯化化限制限制酶切切 脱磷酸化反脱磷酸化反应2供体供体DNA片段的制片段的制备总DNA分离分离纯化化物理切割法物理切割法超声波(超声波(300bp)或)或机械机械
9、搅拌(拌(8kb)或或酶切法切法(内切(内切酶Sau3A进行局部消行局部消化。可得到化。可得到10-30kb的随机片断。的随机片断。)分离特定大小分离特定大小DNA片段片段 超声波超声波300bp,剧烈烈搅拌:拌:8Kb 部分部分酶切切 完全完全酶切切 酶法分离特定大小分离特定大小DNADNA片段片段生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建DNADNA的不完全酶切的不完全酶切目的片段低熔点琼脂糖回收目的片段低熔点琼脂糖回收生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因基因组DNADNA文文库构建的程序构建的程序3.3.载体与基因
10、体与基因组DNA大片段的大片段的连接接直接直接连接、人工接接、人工接头或同聚物加尾。或同聚物加尾。(1)粘性末端直接粘性末端直接连接接:载体与外源体与外源DNA大片段的两个末端都有大片段的两个末端都有相同的粘性末端相同的粘性末端。如:如:Sau3A与与BamHI的的酶切末端。切末端。(2)人工接)人工接头法(法(adapter)人工合成的限制性内切人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。粘性末端片断。接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端各种酶的接头可以向公司定做或购买。各种酶的接头可以向公司定做或购买。生命科学学院生命科学学院一、一、基因组基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因基因组DN
11、ADNA文文库构建的程序构建的程序3.3.载体与基因体与基因组DNA大片段的大片段的连接接(3)同聚物加尾)同聚物加尾粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(三三)基因基因组DNADNA文文库构建的程序构建的程序4.重重组DNA转化受体化受体细胞胞(1)根据克隆)根据克隆载体的性体的性质选择合适的受体合适的受体细胞胞常常见的宿主的宿主细胞:胞:DH5:用于用于铺制与培养制与培养质粒平板和粘粒平板的重粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制缺陷型的抑制型菌株,可与型菌株,可与pUC编码的的 半乳糖苷半乳糖苷酶氨基端氨基端实
12、现 互互补。HB101:用于大用于大规模制模制备质粒的抑制型菌株,粒的抑制型菌株,转化效率高化效率高JM101:可支持可支持带有琥珀突有琥珀突变载体生体生长的宿主菌的宿主菌JM109:支持支持带有琥珀突有琥珀突变载体生体生长的重的重组缺陷的抑制型菌缺陷的抑制型菌MZ-1:温度敏感的溶源性菌株,用于含有噬菌体温度敏感的溶源性菌株,用于含有噬菌体启启动子子质粒粒载体体的宿主菌的宿主菌生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(四四)基因基因组文文库的大小的大小理理论值:基因基因组文文库的克隆数目基因的
13、克隆数目基因组DNA总长/DNA插入插入片段的平均片段的平均长度。度。例如:例如:细菌基因菌基因组DNA总长度度=3 106kb 酶切后的切后的DNA片段平均片段平均长度度=15kb 基因基因组文文库的克隆数的克隆数=3 106kb/15kb=2 105个克个克隆隆生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(四四)基因基因组文文库的大小的大小(必(必须包括一定数量的重包括一定数量的重组子才可能克隆基因子才可能克隆基因组中的任中的任何碱基序列。)何碱基序列。)经验值:N基因基因组文文库克隆克隆总数数 P在基因在基因组文文库中目的基因中目的基因DNA片段的出片段的出现概
14、率概率f插入片段大小与基因插入片段大小与基因组DNA大小比大小比值N =Ln(1 P)Ln(1 f)生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建 ln(1-0.99)ln1-(2104/4.6106)Nhuman=6.9 105 ln(1-0.99)ln1-(2 104/3 109)这个例子说明用质粒载体(插入片断这个例子说明用质粒载体(插入片断5-10kb)就可以建立)就可以建立很好的原核生物基因文库,只需要几千个克隆;而真核生物则很好的原核生物基因文库,只需要几千个克隆;而真核生物则需要更大承载能力的载体。需要更大承载能力的载体。N E.coli=1.1 103F
15、or example:期望值为期望值为0.99,插入片断为,插入片断为20kb的的 E.coli(4.6106 bp)和和 human(3109 bp)基因组的克隆数的计算基因组的克隆数的计算生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建克隆片段克隆片段平均大小平均大小(bp)基因组大小基因组大小/bp2106(细菌)(细菌)2107(真菌)(真菌)2109(动物)(动物)理论克理论克隆数隆数实际克隆实际克隆数数理论克隆理论克隆数数实际克隆数实际克隆数理论克隆数理论克隆数实际克隆数实际克隆数5103400183140001841860000027631101010320
16、091920009208300000138155020103100458100046031500006907744010350278500230075000345 386基因组文库应具有的克隆子数基因组文库应具有的克隆子数生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(五五)DNA文文库的保存的保存1、影印膜影印膜滤保存法保存法生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(五五)DNA文文库的保存的保存2.液体培养基中液体培养基中扩增保存增保存方法:从平板上挑取已方法:从平板上挑取已长出的克隆子出的克隆子转入含适当的抗生入含适当的抗生素培养基中
17、,混素培养基中,混 合的合的细菌生菌生长数代后,其培养物数代后,其培养物于于-70oC储存(加存(加终浓度度为25%的甘油)。的甘油)。缺点:因文缺点:因文库菌落生菌落生长的不均匀性而的不均匀性而导致文致文库中某些特中某些特定的序列定的序列过多或多或过少。少。生命科学学院生命科学学院一、基因组一、基因组DNA文库的构建文库的构建(五五)DNA文文库的保存的保存3.保存保存单个克隆子于含有甘油的培养基中个克隆子于含有甘油的培养基中方法:从平板上挑方法:从平板上挑选单个克隆子接种于合个克隆子接种于合 适的含抗生适的含抗生素的培养基中,菌体生素的培养基中,菌体生长到一定到一定浓度后,加入度后,加入终
18、浓度度为25%的甘油,于的甘油,于-70 oC或或-25 oC下保下保存。存。缺点:需保存的克隆子数缺点:需保存的克隆子数过多,工作量大多,工作量大生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 真核生物基因真核生物基因组DNA十分十分庞大,其复大,其复杂程度是蛋白程度是蛋白质和和mRNA的的100倍左右,而且含有大量的重复序列。倍左右,而且含有大量的重复序列。采用采用电泳分离和泳分离和杂交的方法,都交的方法,都难以直接分离到目的基因。以直接分离到目的基因。这是从染色体是从染色体DNA为出出发材料直接克隆目的基因的一个主要材料直接克隆目的基因的一个主要困困难。高等生物一般具有高等生物
19、一般具有105种左右不同的基因,但在一定种左右不同的基因,但在一定时间阶段的段的单个个细胞或个体中,都尽有胞或个体中,都尽有15%左右的基因得左右的基因得以表达,以表达,产生生约15000种不同的种不同的mRNA分子。可分子。可见,由,由mRNA出出发的的cDNA克隆,其复克隆,其复杂程度要比直接从基因程度要比直接从基因组克隆克隆简单得多。得多。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 cDNA以以mRNA为模板逆模板逆转录出的出的DNA称称cDNA。mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 3 3 5 5 5 5 反转录酶反转录酶引物引物cDNA library利用某种生物的总
20、mRNA合成cDNA,再将这些cDNA与载体连接,转入细菌细胞中进行保存和扩增,称cDNA文库。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 cDNA文文库的特点的特点(1)不含内含子序列。)不含内含子序列。(2)可以在)可以在细菌中直接表达(一般菌中直接表达(一般选用的用的载体都是表达型体都是表达型的)。的)。(3)包含了所有)包含了所有编码蛋白蛋白质的基因。的基因。(4)比)比DNA文文库小的多,容易构建。小的多,容易构建。cDNAcDNA文库既有种属特异性,也有组织特异性。文库既有种属特异性,也有组织特异性。基因特异性、基因特异性、器官特异性、器官特异性、代谢或发育特异性代谢
21、或发育特异性生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建 (一一)cDNA基因文基因文库构建的步构建的步骤1.1.细胞胞总RNARNA的提取和的提取和mRNAmRNA的分离的分离2.2.第一条第一条cDNAcDNA合成合成3.3.第二条第二条cDNAcDNA合成合成4.4.双双链cDNAcDNA克隆克隆进质粒或噬菌体粒或噬菌体载体并体并导入宿主中入宿主中繁殖繁殖生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAcDNA生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(一一)cDNA基因文基因文库构建的步构建的步骤1.总RNA(t
22、otal RNA)提取和)提取和mRNA的分离的分离纯化化提取提取总RNA有商有商业化的化的试剂盒(盒(kit)。)。mRNA的分离的分离纯化化(1)原理)原理利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴,将尾巴,将mRNA从从总RNA(rRNA、tRNA等)中分离等)中分离纯化。化。mRNA只占只占总RNA的的1%-2%。(2)mRNA的分离的分离纯化化Column(柱)(柱)分离分离mRNA用商用商业化的化的Oligo dT纤维柱。柱。生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(
23、一一)cDNA基因文基因文库构建的步构建的步骤1.cDNA第一第一链合成合成逆逆转录酶能以能以RNA为模板合成模板合成DNA。用用Oligo dT(或随机引物)作引物,合成(或随机引物)作引物,合成cDNA的第一的第一链。反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 5 5 AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOligo dTOligo dT引物引物生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建降解降解mRNAmRNA模板模板用用碱碱处理理或用或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的交分子中的mRNA。mRNAmRNAcDNAcDNA3 3
24、5 5 5 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAmRNAcDNAcDNA第一链第一链3 3 3 3 5 5 5 5 引物引物cDNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物或或RNaseHRNaseH碱碱生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建(一一)cDNA基因文基因文库构建的步构建的步骤3.cDNA第二第二链合成(合成(自身引自身引导法和法和置置换合成法合成法)剩下的剩下的cDNA单链的的3末端一般形成一个弯回来的双末端一般形成一个弯回来的双链发卡卡结构(机理不明),可成构(机理不明),可成为合成第二条合成第二条cDNA链的引的引物。用物。用DNA聚合聚合酶合成第二合成
25、第二链DNA。cDNA第一链第一链5 cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建去掉去掉发卡卡结构构用用核酸核酸酶S1可以切掉可以切掉发卡卡结构(但构(但这会会导致致cDNA中有中有用的序列被切掉!)。用的序列被切掉!)。核酸酶核酸酶S1cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 5 3 生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建1 1自身引导法自身引导法生命科学学院生命科学学院二、二、cDNA文库构建文库构建生命科学学院
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