灭菌接种与培养.pptx
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1、第四章第四章 灭菌、接种与培养灭菌、接种与培养一、灭菌一、灭菌(一)(一)玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌:玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌:干热灭菌干热灭菌是利用烘箱加热到是利用烘箱加热到160180的温度来杀死微生物。的温度来杀死微生物。通常采用通常采用170持续持续90分钟来灭菌。干热灭菌的物品分钟来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为包扎。灭菌时应渐要预先洗净并干燥,工具等要妥为包扎。灭菌时应渐进升温,达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物进升温,达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多。到指定时间断电后,待充分冷凉品的数量不宜过多。到指定时间断电后,待充分冷凉
2、,才能打开烘箱。,才能打开烘箱。(二)不耐热的物质采用过滤灭菌:(二)不耐热的物质采用过滤灭菌:一些生长调节剂,如一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的,不赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的,不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法。能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法。防细菌滤膜的网孔的直径为防细菌滤膜的网孔的直径为0.45mm以下,当溶液以下,当溶液通过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直通过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻,径而被阻,(三)空间采用紫外线和熏蒸灭菌(三)空间采用紫外线和熏蒸灭菌(1)紫外线灭菌:紫外线灭菌:在
3、接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌。细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色体线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异,造成死亡。变异,造成死亡。紫外线的波长为紫外线的波长为200300nm,其中以,其中以260nm的杀菌能的杀菌能力最强,但是紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只适力最强,但是紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只适于空气和物体表面的灭菌,且要求距照射物以不超过于空气和物体表面的灭菌,且要求距照射物以不超过1.2米为宜。米为宜。(2)熏蒸
4、灭菌:用加热焚烧、氧化等方法熏蒸灭菌:用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变,使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面的微为气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭紧密即生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭紧密即可。可。v化学消毒剂能使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,化学消毒剂能使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细或降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解。胞破裂或溶解。v一般说来,温度越高,作用时间越长,杀菌效果越一般说来,温度越高,作用时间越长,杀菌效
5、果越好。消毒剂的浓度一般是浓度越大,杀菌能力越强,好。消毒剂的浓度一般是浓度越大,杀菌能力越强,但石炭酸和酒精例外。但石炭酸和酒精例外。v常用熏蒸剂是甲醛。熏蒸时,房间关闭紧密,按常用熏蒸剂是甲醛。熏蒸时,房间关闭紧密,按68ml/m3用量,将甲醛置于广口容器中,加用量,将甲醛置于广口容器中,加g高高锰酸钾促进挥发。冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效锰酸钾促进挥发。冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果不如甲醛。果不如甲醛。(四四)一些物体表面用药剂喷雾灭菌:一些物体表面用药剂喷雾灭菌:物体表面可用一物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材
6、料表面等。可用面、植物材料表面等。可用70的酒精反复涂擦的酒精反复涂擦灭菌,灭菌,12的来苏儿溶液以及的来苏儿溶液以及0.251的新的新洁尔灭也可以。洁尔灭也可以。(五五)植物材料表面用消毒剂灭菌:植物材料表面用消毒剂灭菌:从外界或室内选取的植物材从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。养基,便会造成培养基污染。首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净。分仔细洗干净。第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱
7、第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、酒精、消毒液、无菌水、手表等。用无菌水、手表等。用70%酒精浸酒精浸10-30s。处理完的材料在无。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。第三步是用灭菌剂处理。第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取据情况选取12 种使用。种使用。表表42常用灭菌剂使用浓度及效果比较常用灭菌剂使用浓度及效果比较灭菌剂灭菌剂 使用浓度使用浓度 持续时间持续时间(
8、min)去除的难易去除的难易 效果效果次氯酸钙次氯酸钙 910%530 易易 很好很好次氯酸钠次氯酸钠 2%530 易易 很好很好氯化汞氯化汞 0.11%58 较难较难 最好最好抗菌素抗菌素 450mg/L 3060 中中 较好较好v而用升汞液灭菌的材料,因升汞残毒较难去除,应当而用升汞液灭菌的材料,因升汞残毒较难去除,应当用无菌水涮洗用无菌水涮洗810次,每次不少于次,每次不少于3min,以尽量去,以尽量去除残毒。除残毒。v灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其它器皿中,灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其它器皿中,记好时间,倒入消毒溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以记好时间,倒入消毒溶液,不
9、时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。毒彻底。v在快到时间之前在快到时间之前12min,开始把消毒液倾入一备好的,开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内,要注意勿使材料倒出,倾净后立即倒入无菌大烧杯内,要注意勿使材料倒出,倾净后立即倒入无菌水,轻搅涮洗。水,轻搅涮洗。v灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。v在灭菌溶液中加吐温在灭菌溶液中加吐温-80或或Triton X效果较好,这些表效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布,更容易浸入到面活性剂
10、主要作用是使药剂更易于展布,更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加,灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的1.5%,即在,即在100ml加入加入1.5滴。滴。v最后一步是用无菌水冲洗,冲洗要每次最后一步是用无菌水冲洗,冲洗要每次3min左右,视左右,视采用的消毒液种类,冲洗采用的消毒液种类,冲洗310次左右。无菌水冲洗作次左右。无菌水冲洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。二、无菌操作二、无菌操作1、接种室要严格进行空间消毒。接种室内保
11、持定期用、接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1-3%的的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。2、工作人员进入接种室前双手必须进行消毒,先用水和肥皂、工作人员进入接种室前双手必须进行消毒,先用水和肥皂洗涤,操作前再用洗涤,操作前再用70%酒精擦试,操作时双手不能随便接触酒精擦试,操作时双手不能随便接触未经消毒的东西。未经消毒的东西。3、入室前穿好灭过菌的专用实验服,专用实验服要经常保持、入室前穿好灭过菌的专用实验服,专用实验服要经常保持清洁并消毒。清洁并消毒。4、操作规程过程禁止不必要的谈话和咳嗽。还要尽量减、操作规程过程禁止不必要的谈话
12、和咳嗽。还要尽量减少工作人员在接种室内的走动。少工作人员在接种室内的走动。5、操作期间尽量把所用的器皿盖子盖好。刀、剪、镊子、操作期间尽量把所用的器皿盖子盖好。刀、剪、镊子等用具,一般在使用前浸泡在等用具,一般在使用前浸泡在70的酒精中,用时再在的酒精中,用时再在火焰上消毒,待冷却后使用。火焰上消毒,待冷却后使用。6、每次使用前均需进行用具消毒。工作结束,及时取出、每次使用前均需进行用具消毒。工作结束,及时取出接种材料,然后清理台面,再用的来苏儿或石炭酸接种材料,然后清理台面,再用的来苏儿或石炭酸全面喷雾或打开紫外线照射半小时。全面喷雾或打开紫外线照射半小时。三、接种三、接种 接种是将经严格的
13、表面灭菌处理好外植体(如种子,接种是将经严格的表面灭菌处理好外植体(如种子,根、茎、叶等离体器官),经切割或剪裁成小段或小块,根、茎、叶等离体器官),经切割或剪裁成小段或小块,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。1、将初步洗涤及切割的材料放入烧杯,带入超净台上,、将初步洗涤及切割的材料放入烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗最后沥去水分,取出用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗最后沥去水分,取出放置在灭过菌的层纱布上或滤纸上。放置在灭过菌的层纱布上或滤纸上。2、材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对、材料吸干后,一手拿镊子
14、,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切割。如叶片切成材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm见方的小块;见方的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含12片片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染。械,防止交叉污染。3、用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养、用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。基上。具体操作是:具体操作是:v先解开包口膜,将培养瓶几乎水平拿着,培养瓶口靠近酒精先解开包口膜,将培养瓶几乎水平拿着,培养瓶口靠近酒精灯焰,将瓶口在火焰
15、上方转动,让瓶口里外灼烧数秒钟。灯焰,将瓶口在火焰上方转动,让瓶口里外灼烧数秒钟。v然后用镊子夹取外植体送入瓶内,轻轻插入培养基上。至于然后用镊子夹取外植体送入瓶内,轻轻插入培养基上。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上尖端向上)其它尚无统一其它尚无统一要求。要求。v放置材料数量现在倾向少放,一旦培养物污染可以抛弃。接放置材料数量现在倾向少放,一旦培养物污染可以抛弃。接完种后,将瓶口在火焰上再灼烧数秒钟,包上包口膜。完种后,将瓶口在火焰上再灼烧数秒钟,包上包口膜。四、培养四、培养v培养培养是指把接种后的培养材料放在培养室是指把接种后的培养材料放在培养室(有
16、光照、温有光照、温度条件度条件)里,使之生长,分裂、分化形成愈伤组织或进里,使之生长,分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。一步分化成再生植株的过程。(一)培养方法(一)培养方法1、固体培养法:、固体培养法:即用琼脂固化培养基来培养植物材料的即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法方法。是现在最常用的方法。该法设备简单,易行。该法设备简单,易行。但养分分布不均,生长速度不均衡。并常有褐化中毒但养分分布不均,生长速度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。现象发生。2、液体培养法:、液体培养法:即用不加固化剂的液体培养基培养植即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。
17、由于液体中氧气含量较少,常需要物材料的方法。由于液体中氧气含量较少,常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给,通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给,采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养,其速度一采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养,其速度一般为般为50100r/min,这种定期浸没的方法,既能使,这种定期浸没的方法,既能使培养基均一,又能保证氧气的供给。培养基均一,又能保证氧气的供给。(二二)培养步骤培养步骤1、初代培养:、初代培养:即接种某种外植体后,最初的几代培养。即接种某种外植体后,最初的几代培养。根据初代培养时发育的方向可分为:根据初代培养时发育的方向可分为:(1)顶芽和腋芽
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- 灭菌 接种 培养
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