液相色谱中.pptx

液相色谱（二）液相色谱（二）Liquid chromatographyLiquid chromatography主要内容主要内容按分离机理的层析分类12凝胶柱效测定3离子交换色谱的原理与操作4凝胶色谱的分离原理与操作一.按分配机理的层析分类凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱离子交换色谱离子交换色谱反相色谱反相色谱疏水色谱疏水色谱亲和色谱亲和色谱离子交换剂（离子交换剂（P143P143）高分子类交换剂：Sephadex,Sepharose,BioGel,Cellulose等三.离子交换色谱的分离原理与操作常用的离子交换树脂常用的离子交换树脂常用的离子交换树脂常用的离子交换树脂强酸性阳离子交换树脂：活性基团是强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SOSO3 3H H（磺酸基）磺酸基）和和-CHCH2 2SOSO3 3H H（次甲基磺酸基）；次甲基磺酸基）；弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH,-COOH,-OCHOCH2 2COOH,CCOOH,C6 6H H5 5OHOH等弱酸性基团；等弱酸性基团；强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基胺基或二甲基-羟基乙基胺基；羟基乙基胺基；弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；较弱；DEAE anion exchangerCMC Cation Exchanger2）、性能评价）、性能评价A 交交 换换 容容 量量(exchange capacity)指单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数(mmol)，是表征交换剂离子交换能力的主要参数。B 交换容量的测定交换容量的测定对对于于阳阳离离子子交交换换剂剂：用HCl将其处理成氢型，称重并测定其含水量；称数克交换剂，加入到过量已知浓度的NaOH溶液，发生交换反应待反应达到平衡后(强酸性的需要静置24h，弱酸性的需静置数日)，测定剩余的NaOH摩尔数，就可求得阳离子交换剂的交换容量。对对于于阴离离子子交交换换剂剂：将阴离子交换剂转换成Cl型后，取一定量的Cl型交换剂，通入Na2SO4,用铬酸钾作指示剂，用硝酸银溶液滴定流出液的Cl-，根据Cl-量计算交换容量。蛋蛋白白质质的的交交换换容容量量：比小分子化合物要小的多(见表)。Why?1st 1st 树脂孔道的空间排阻作用大；树脂孔道的空间排阻作用大；2 2ndnd 交换后排阻其他蛋白质的扩散和交换；交换后排阻其他蛋白质的扩散和交换；3 3rdrd 蛋白质的多电荷与多个交换中心结合蛋白质的多电荷与多个交换中心结合ion exchange chromatography（IEC）定义：利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。三.离子交换色谱的分离原理与操作One protein ,PI=6.9 If in the buffer,pH=5.9One protein ,PI=6.9 If in the buffer,pH=7.9anion exchangerscation exchangers交换剂的选择交换剂的选择?(p146)分离物质为两性离子分离物质为两性离子,应根据其在应根据其在稳定的稳定的稳定的稳定的pHpH范围范围范围范围内所带内所带电荷来选择交换剂电荷来选择交换剂.strong ion exchangers 适用的pH范围很广,常用来制备无离子水,分离在极端pH溶液中解离且较稳定的物质lweak ion exchangers-适用的pH范围窄,但在pH为中性的溶液中交换容量也高,用于分离生命大分子物质,活性保持。离子交换层析的基本步骤平衡上样吸附洗脱再生+-anion exchange beadEquilibrationSample applicationand wash-+-Elution-+-Regeneration-+Sampleapplicationand washElutionEquilibrationRegeneration-+-动画动画层析柱平衡层析柱平衡缓冲液的用量至少为柱体积的缓冲液的用量至少为柱体积的 2 2 倍倍平衡缓冲液的流速可平衡缓冲液的流速可略高略高于正常操作流速于正常操作流速平衡终点以流出液的平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、离子浓度、导电性、pHpH值与缓值与缓冲液一致为准，其中冲液一致为准，其中pHpH值最重要值最重要样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高洗脱洗脱1st恒定洗脱恒定洗脱缺点：洗脱体积大缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽溶质洗脱不尽2nd 线性梯度洗脱线性梯度洗脱(linear gradient elution)线性梯度洗脱的优缺点线性梯度洗脱的优缺点优点：流动相离子强度I、pH连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广；缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。3rd阶梯洗脱法阶梯洗脱法(stepwise elution)优点优点：无须特殊设备，操作简单；缺点缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。样品洗脱样品洗脱1.一般用在工艺摸索初期，能快速的得到目的蛋白和杂蛋一般用在工艺摸索初期，能快速的得到目的蛋白和杂蛋白的洗脱性质，减小配一系列盐浓度的工作量。白的洗脱性质，减小配一系列盐浓度的工作量。2.根据线性梯度洗脱的结果，采用最佳的阶段洗脱方式。根据线性梯度洗脱的结果，采用最佳的阶段洗脱方式。离子交换色谱在操作上的注意之处离子交换色谱在操作上的注意之处注意各种厂家提供柱材料的注意各种厂家提供柱材料的pH范围；注意流范围；注意流速范围（压力范围），以免损坏胶颗粒。速范围（压力范围），以免损坏胶颗粒。注意装柱（均匀，无气泡），保养（高盐再生）注意装柱（均匀，无气泡），保养（高盐再生）及贮存（加防腐剂）。及贮存（加防腐剂）。准备样品使其处于与平衡缓冲液相同的准备样品使其处于与平衡缓冲液相同的pH及及离子强度的环境之中，注意样品的溶解性，不离子强度的环境之中，注意样品的溶解性，不要有沉淀产生及颗粒物质要有沉淀产生及颗粒物质;样品中应该避免含样品中应该避免含有去污剂及尿素、硫脲等。有去污剂及尿素、硫脲等。样品总量不应超过柱的结合容量样品总量不应超过柱的结合容量,上样体积一般上样体积一般无特殊的限制。无特殊的限制。在位清洗和在位消毒在位清洗（除去柱床的沉淀蛋白和顽固蛋白）除脂类、疏水蛋白的方法：使用递增式梯度以4 410 10 CV 70%CV 70%乙醇或30%异丙醇洗柱，再用至少3CV蒸馏水过柱；或以0.5%非离子性去污剂（溶于1 1mol/Lmol/L乙酸中）洗柱，再用5CV 70%乙醇过柱，最后用4 41010CVCV蒸馏水加以清洗。注意：亲和层析介质在位清洗方法需参见包装说明书在位消毒（将微生物感染降到最低）方法：用用0.50.51 1mol/Lmol/L氢氧化钠以该凝胶的建氢氧化钠以该凝胶的建议流速洗议流速洗柱柱，约约0.50.51 1h h 然后以最少然后以最少3 3CVCV平衡平衡缓冲液过柱缓冲液过柱 优点优点处理量大，浓缩，高速；选择高，所需柱长较短；回收率高；离子交换剂种类多，价格也远低于亲和吸附剂。IEC特点特点缺点缺点IEC的操作变量远多于GFC，影响分离特性的因素非常复杂。二.离子交换色谱的应用分离纯化（分离纯化（通用性；高选择性）由于蛋白质是两性电解质，在不同的由于蛋白质是两性电解质，在不同的pHpH值下，其解值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定以用阴离子交换，可视具体情况而定由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用通常采用弱阳或弱阴弱阳或弱阴离子交换剂离子交换剂适当调节缓冲溶液的适当调节缓冲溶液的pHpH值，使蛋白质适当解离，值，使蛋白质适当解离，通常采用的通常采用的pHpH值靠近其等电点（不是等电点）值靠近其等电点（不是等电点）操作要点操作要点 一、原理与操作一、原理与操作1疏水性相互作用层析的原理疏水性相互作用层析的原理疏疏 水水 性性 相相 互互 作作 用用 层层 析析(Hydrophobic interaction chromatography，HIC)是利用表面偶联弱弱疏疏水水性性基基团团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。亲水性蛋白质表面均含有一定量的疏水性基团，疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸等)含量较多的蛋白质疏水性基团多，疏水性也大。四四 疏水性相互作用层析疏水性相互作用层析(P155)(P155)尽管在水溶液中蛋白质具有将疏水性基团尽管在水溶液中蛋白质具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的作用，但总有一些疏水性基团或极性基团的疏作用，但总有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质表面。这部分疏水基团可水部位暴露在蛋白质表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基发生疏水性相互作用，被固定相弱疏水基发生疏水性相互作用，被固定相(疏疏水性吸附剂水性吸附剂)所吸附。所吸附。疏疏水水性性吸吸附附剂剂 各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。常用的疏水性配基主要有苯苯基基、短短链链烷烷基基(c3c8)、烷烷氨氨基基、聚聚乙乙二二醇醇和和聚聚醚醚等。因疏水性吸附作用与配基的疏水性(疏水链长度)和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，疏水性高的配基应较疏水性低的配基修饰密度低。一般配基修饰密度在（1040）mo1cm3之间。配基修饰密度过小则疏水性吸附作用不足，密度过大则洗脱困难。图7-12 疏水性吸附剂 图图中中a a的的末末端端氨氨基基以以及及a a和和b b的的键键合合亚亚氨氨基基显显弱弱碱碱性性，在在中中性性pHpH范范围围内内带带正正电电荷荷，因因此此，这这类类疏疏水水件件吸吸附附剂剂除除疏疏水水性性吸吸附附外外，还还可可能能存存在在静静电电吸吸附附(离离子子交交换换)作作用用。图图中中c c的的吸吸附附剂剂利利用用醚醚键键结结合合不不引引入入荷荷电电基基团团，对对蛋蛋白白质仅产生疏水性吸附作用。质仅产生疏水性吸附作用。2)影响因素影响因素(p156)1st 水化层水化层(hydration shell)tight hydration shell(0.35g water/1g pro)loose hydration shell(2g water/1g pro)2nd ionic strength3rd|pH水 pI|Value|pH水 pI|Value zeta电势 水化层4th 增加亲水性物质离子：SCN-，ClO4-，I-有机物：乙二醇、丙三醇等含羟基物质5th 表面活性剂Tight hydration shellProtein coreLoose hydration shell洗脱方法洗脱方法?3)、洗脱方法、洗脱方法降低离子强度降低离子强度增加增加|pHpI|乙二醇乙二醇orI-表面活性剂表面活性剂2 2疏水性相互作用层析的操作疏水性相互作用层析的操作 吸附生物大分子采用柱层析法，装柱和拆柱与其他类型的柱层析法相同。为了使要分离的生物大分子能紧密结合在柱上，选择适当的缓冲液、pH和离子强度，也要考虑温度因素。为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子，可以用下列的一种或几种方法：改换一种具有较低盐析效应的离子；降低离子强度；增加洗脱剂的极性，也可加入乙二醇；用含有表面活性剂的洗脱剂 每次实验结束后，吸附剂需要再生。因为吸附剂中尚留有结合紧密的生物大分子、表面活性剂等。未经再生的疏水吸附剂，其吸附容量将明显降低。一般来说可用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸馏水依次洗涤，装柱，用初始缓冲液平衡吸附剂。吸附剂经再生后可反复使用。蛋白质的纯化过程中，各种分离技术结合的顺序是很重要的。疏水层析可用在沉淀步骤之后，或与凝胶过滤、离子交换层析结合使用。二、疏水性相互作用层析的应用及特点二、疏水性相互作用层析的应用及特点1st互互补补工工具具：HIC主主要要用用于于蛋蛋白白质质类类分分离离纯纯化化，虽虽然然HIC不不如如IEC的的应应用用广广泛泛，但但可可以以作作为为IEC的的互互补补工工具具。如如方方法法得得当当，HIC与与IEC的分离效率相当。的分离效率相当。2nd与与盐盐析析衔衔接接：由由于于在在高高浓浓度度盐盐溶溶液液中中疏疏水水性性较较大大，因因此此HIC可可直接分离盐析后的蛋白质溶液。直接分离盐析后的蛋白质溶液。3rd可可以以通通过过调调节节疏疏水水性性配配基基链链长长和和密密度度来来控控制制吸吸附附性性能能的的大大小小，因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。4th疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。五五 反相层析反相层析 反相层析反相层析(ReversedReversedphase phase chromatographychromatography，RPC)RPC)是是利利用用非非极极性性的的反反相相介介质质为为固固定定相相，极极性性有有机机溶溶剂剂的的水水溶溶液液为为流流动动相相，根根据据溶溶质质极极性性(疏疏水水性性)的的差差别别进进行行溶溶质质分离纯化的洗脱层析法。分离纯化的洗脱层析法。与与前前述述HICHIC同同样样，RPCRPC中中溶溶质质也也通通过过疏疏水水性性相相互互作作用用分分配配于于固固定定相相表表面面，但但是是RPCRPC固固定定相相表表面面完完全全被被非非极极性性基基团团所所覆覆盖盖，表表现现强强烈烈的的疏疏水水性性。因因此此，必必须须采采用用极极性性有有机机溶溶剂剂（如如甲甲醇醇、乙乙氰氰等等）或或其其水水溶溶液进行溶质的洗脱分离。液进行溶质的洗脱分离。RPC主主要要用用于于相相对对分分子子质质量量低低于于5000，特特别别是是1000以以下下的的非非极极性性小小分分子子物物质质的的分分析析和和纯纯化化，也也可可用用于于蛋蛋白白质质等等生生物物大大分分子子的的分分析析和和纯纯化化。由由于于反反相相介介质质表表面面为为强强烈烈疏疏水水性性，并并且且流流动动相相为为低低极极性性有有机机溶溶剂剂，生生物物活活性性大大分分子子在在RPC分分离离过过程程中中容容易易变变性性失失活活。所所以以，以以回回收收生生物物活活性性蛋蛋白白质质为为目目的的时时，应应注意选用适宜的反相介质。注意选用适宜的反相介质。溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。例例如如，烃烃类类化化合合物物的的分分配配系系数数与与其其分分子子所所含含碳碳原原子子数数成成正正比比。与与其其它它层层析析法法一一样样，当当固固定定相相一一定定时时，可可通通过过调调节节流流动动相相的的组组成成调调整整溶溶质质的的分分配配系系数数。流流动动相相的的极极性性越越大大，溶溶质质的的分分配配系系数数越越大大。因因此此RPCRPC多多采采用用降降低流动相极性低流动相极性(水含量水含量)的线性梯度洗脱法。的线性梯度洗脱法。反反相相介介质质的的商商品品种种类类繁繁多多，其其中中最最具具代代表表性性的的是是以以硅硅胶胶为为载载体体，通通过硅烷化反应在硅胶表面缝合非极性分子层制备。硅烷化反应式为：过硅烷化反应在硅胶表面缝合非极性分子层制备。硅烷化反应式为：除硅胶外，高分子聚合物也可作为反相介质的载体，如TSK gel Octodecyl4PW和TSK gel OctadecylNPR(聚丙烯酸酯C18)等。反相介质性能稳定，分离效率高，可分离蛋白质、肽、氨基酸、核酸、脂类、脂肪酸、糖类、植物碱等含有非极性基团的各种物质。因此，RPC做为定量分析手段，广泛应用于科学研究、临床诊断、工业检测和环境保护等各个行业。做为产品纯化制备手段，由于反相介质与其分离的对象相比价格较高，多限于实验室规模的应用，在大规模工业生产中应用较少。正相色谱(了解)运用极性固定相和弱极性非极性流动相,这种经典的色谱模式被称为正相。反相色谱与疏水色谱的不同在哪几方面(P155)LOGO“Add your company slogan”Heard melodies are sweet,but those unheard are sweeterHeard melodies are sweet,but those unheard are sweeterWho neglects learning in his youth,Who neglects learning in his youth,loses the past and is dead for the future.loses the past and is dead for the future.