人工感染PRRSV仔猪心脏的临床表现和病理变化.pdf

【目的】了解PRRSV感染对仔猪心脏的损伤特点。【方法】以PRRSVJXA1株感染约5周龄长白仔猪，出现临床症状后，使用听诊器检查人工感染组和正常对照组仔猪的心音变化，发病第3天，剖检并取左心室壁组织，制作石蜡切片，HE染色观察病理变化，免疫组织化学染色检测PRRSVN蛋白分布。【结果】心脏听诊结果显示，感染仔猪第二心音显著性增强，部分仔猪心动过速或心律不齐，偶有轻微心包拍水音；剖检结果显示，感染仔猪心包膜略增厚，心包腔少量积液，心脏横径略大，质地较软，心肌有出血点；HE染色结果显示，感染仔猪心肌组织出现淤血、淋巴细胞浸润、颗粒变性等病理性变化；免疫组织化学染色结果显示，PRRSVN蛋白在心肌组织分布广泛，不仅分布于心肌细胞，也分布于血管内皮细胞。【结论】PRRSVJXA1株人工感染第3天，即引起仔猪心脏功能变化和心肌组织病变，这表明在该病毒病的治疗中应尽早加强对心脏功能的保护。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；心脏听诊；血管内皮细胞；病理变化；淤血中图分类号：S852.35文章编号：10 0 2-318 6（2 0 2 4)0 2-0 0 6 2-0 7 文献标志码：ACardiac clinical symptoms and pathological changes inexperimentally PRRSV-infected pigletsLI Hanqi,LIU Yang,GUO Wei,FU Yequan,WANG Jianfang,ZHANG Tao*(Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine,Animal Science andTechnology College,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)Abstract:Objective To comprehend the heart damage of piglets caused by PRRSV infection.MethodsJ Landrace pigletsabout 5 weeks old were artificially infected with PRRSV JXAl strain.After the onset of obvious clinical symptoms,the heartsounds of piglets were diagnosed by a stethoscope.At three days post infection,piglets were autopsied and the ventricular parie-tal tissues were sampled to prepare the paraffin sections.The pathological changes of piglet hearts were detected by the Hema-tein-Eosin staining,and the PRRSV N protein were determined by immunohistochemical staining.ResultsJ Cardiacauscultation showed that the second heart sound of infected piglets was significantly enhanced,and there were tachycardia andarrhythmia and occasional pericardial patting sounds in some infected piglets.The cardiac autopsy showed that the slightlythickened pericardium,small amount of fluid in pericardial space,the slightly larger transverse cardiac diameter,the softer tis-sues,and some myocardial hemorrhagic spots in infected piglets.HE staining indicated myocardial tissue congestion,lymphocyte infiltration and granular degeneration,etc,Immunohistochemical staining indicated that PRRSV N protein waswidely detected in myocardial tissue,not only in myocardial cells,but also in vascular endothelial cells.Conclusion Three dayspost infection with PRRSV JXAl strain,cardiac function changes and pathological changes of myocardial tissues were directlycaused,which suggests the cardiac function protection should be strengthened as soon as possible in the treatment of PRRSV-infected piglets.Keywords:porcine reproductive and respiratory syndrome virus;cardiac auscultation;vascular endothelial cells;pathologicalchange;congestion收稿日期：2 0 2 4-0 2-2 9基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.32273050）第一作者：李汉奇（2 0 0 0），河南省安阳人，硕士生研究生，研究方向：中兽医学，E-mail：8 7 6 47 8 96 7 q q.c o m通信作者：张涛（198 0），研究方向：畜禽疾病的中兽医防治及其机制，E-mail：z h a n g t a o 8 0 0 8 12 6.c o m2024年第2 期近30 年来，猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)给中国养猪业带来了严重经济损失。国内外对PRRSV致病机制进行了持续性深人研究，较全面了解了PRRSV抗原结构特点11、猪肺泡巨噬细胞等宿主细胞在其感染中的病理变化和反应，但截至目前,对该病毒的致病机制仍有诸多问题有待阐明,对其带来的危害仍缺乏有效的防治措施。已有研究显示3,4，仔猪肺脏等呼吸器官虽然被认为是PRRSV感染的主要损伤部位，但其他组织器官在感染过程的病理变化也值得关注。心脏与肺脏关系密切,血液循环中二者直接相连,肺脏的感染和病变极易影响到心脏，病毒性心肌炎也是呼吸道病毒病的重要致死原因之一,已被证明普遍发生于流感病毒、新型冠状病毒等的感染中5。感染PRRSV仔猪心脏组织中的病毒分布及其损伤亦有报道6.7，但是，心脏损伤在PRRSV感染中的作用尚未得到足够重视，对心脏功能和病理变化的系统研究较少。为较全面了解PRRSV感染对仔猪心脏的影响，该研究以PRRSV人工感染仔猪，检查其心脏临床听诊音的变化特点，分析心肌组织的病理变化，及检测病毒抗原在心肌组织细胞的分布，以期为全面阐明PRRSV致病机制和感染仔猪的临床防治提供参考。1材料与方法1.1主要仪器生物组织石蜡包埋机（型号YB-6LF，湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司），展片机（型号ZPJ-1A，天津天利航空机电有限公司），石蜡切片机（型号RM2235，德国Leica公司），倒置荧光数码显微镜（型号IX-71，日本Olympus公司）等。1.2主要试剂苏木素染色液（货号C0105-1）、伊红染色液（货号C0105-2），购自碧云天生物技术有限公司；免抗PRRSVN蛋白多克隆抗体（货号BS-23941R），购自北京博奥森生物科技有限公司；兔SP试剂盒（货号SP-9001）D A B试剂盒（货号ZLI-9017），购自北京中杉金桥生物技术有限公司；柠檬酸钠抗原修复液（货号C1032），购自北京索莱宝科技有限公司。1.3病毒高致病性PRRSVJXA1株，由兽医学（中医药）北京市重点实验室冻存，在Marc-145细胞培养增殖，冻融3次，裂解细胞释放病毒，离心去除细胞碎李汉奇等：人工感染PRRSV仔猪心脏的临床表现和病理变化树胶封片，显微镜观察、拍照。1.8免疫组织化学染色将脱蜡的切片置于柠檬酸钠抗原修复液中，微波加热进行抗原修复，PBS充分浸洗，参照SP试剂盒说明书，采用免疫组织化学染色法检测PRRSVN蛋白，苏木素溶液复染，中性树胶封片，显微镜观察、拍照。2结果2.1心脏听诊音变化正常对照组仔猪试验期间临床表现无异常，心率约为9 4次/min，心脏听诊无明显异常；PRRSV感染组仔猪感染第3天起，出现体温升高、扎堆、颤抖,呼吸困难等临床症状，心率约为10 5次/min，心脏听诊第二心音显著性增强，在肺动脉瓣处尤为明显，2 头仔猪出现心动过速或心律不齐，1头猪偶可听到轻柔性心包拍水音。2.2心脏的大体病理变化人工感染PRRSV仔猪心脏剖检显示（图1），心包膜略有增厚，心包腔有少量淡黄色积液；与正常63片,取上清冻存于一8 0 备用；同时取正常对照Marc-145细胞，采用相同方法处理，取上清作为对照液。1.4试验猪与处理约35d龄长白仔猪购自北京原种猪场，分为对照组和病毒感染组，每组3头，分栏饲养，栏间以木板分隔为相对独立区域，自由采食和饮水。病毒感染组分别经滴鼻和肌肉注射途径接种病毒液1 mL，对照组采用相同方法接种对照液。动物试验操作经北京农学院动物福利与伦理委员会批准（No.BUA_ZT2022012)。1.5心脏的临床检查病毒感染组出现明显临床症状后，使用听诊器听取各组仔猪心音变化和心脏杂音情况。1.6石蜡切片感染组仔猪出现明显临床症状后第3天，先按50mg/kg体重的剂量腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉，然后腋下动脉放血法处死，剖检取心脏，于左心室壁采样，4%多聚甲醛固定2 4h，将固定组织块修整为长、宽约1cm，厚约0.5cm，常规方法包埋，制作5m厚石蜡切片，脱蜡后进行HE和免疫组织化学染色。1.7 HE染色采用常规方法进行HE染色、脱水和透明，中性64北京农学院学报第39卷对照组相比，心脏的横径略大，心脏质地较软，心肌可见出血点，剖开心室壁可见心腔内有稀薄血液或血凝块。AB5050MmDA.正常对照组；B.人工感染组图1人工感染PRRSV仔猪心脏剖检变化A,Control group;B.PRRSV-infected groupFig.1 Gross pathological changes of the piglet hearts arti-ficially infected with PRRSV2.3心肌组织的病理变化HE染色结果显示（图2），人工感染PRRSV仔猪心肌组织明显淤血，心肌纤维间可见大量红细胞，有少量淋巴细胞浸润，心肌细胞呈现颗粒变性，少量肌纤维断裂，细胞核染色较深。对照组仔猪的心脏组织结构正常，无病理性变化。50mA.正常对照组；B.人工感染组。空心箭头示红细胞；细黑箭头示白细胞；粗黑箭头示变性颗粒图2、人工感染PRRSV仔猪心肌组织HE染色A.Control group;B.PRRSV-infected group.Hollowarrows indicates red blood cells,thin black arrows indicateswhite blood cells，a n d th ic k b la c k a r r o w s in d ic a te sdegeneratedgranulesFig.2PRRSV2.4PRRSVN蛋白在心肌组织的分布免疫组织化学染色结果显示（图3），人工感染PRRSV仔猪心肌组织呈PRRSVN蛋白阳性着色。PRRSVN蛋白在心肌组织的阳性着色部位较广泛,不仅分布于心肌细胞，也分布于血管内皮细胞。3讨论和结论PRRSV感染仔猪虽然主要以引起呼吸道病变为特征的疾病，但是病毒随着血液会侵入心脏，如果仔猪的抵抗力弱，就有可能引起心肌炎，进而出现心功能紊乱，甚至造成动物休克和死亡。该研究50umA/C.正常对照组，B/D.人工感染组，黑箭头示阳性着色心肌细胞，空心箭头示阳性着色毛细血管内皮细胞图3PRRSVN蛋白在仔猪心肌组织的免疫组织化学染色结果A/C.Control group;B/D.PRRSV-infected group.Blackarrows indicate positive myocardial cells,and hollow arrows in-dicate posivite capillary endothelial cellsFig.3Immumohistochemical staining of PRRSV NBprotein in the piglet myocardial tissue通过对人工感染PRRSV仔猪进行心脏听诊检查、心肌组织病理切片分析和PRRSV抗原检测，从多个层面的结果显示了该病毒对感染仔猪心脏功能和心肌组织的影响。50m心音变化是反应心脏功能状态的重要临床指标,能够提示心脏的病变,指导临床诊断和治疗,评估患病动物的病情变化和治疗效果。有关PRRSV感染对仔猪心脏的影响，对其临床症状的关注较少，当前尚未见听诊心音变化的报道。尽管在猪病的诊断和防治过程中，一般不将心脏听诊作为主要内容，但通过心音变化了解PRRSV感染时仔猪心脏的功能状态，有助于全面掌握该病毒感染的危Hematoxylin-eosinstaining of the pigletmyocardial tissue artificially infected1with50m害。一般认为，心脏病变是PRRSV感染较晚期的特征，该研究对感染仔猪出现临床症状早期进行临床检查发现，感染仔猪均出现肺动脉瓣处第二心音显著增强,其原因可能是肺循环功能障碍引起的肺动脉压力增高；另外，感染猪中有2 头猪心动过速或心律不齐，1头猪出现轻柔心包拍水音，这提示感染可能已引起了仔猪心肌和心包的炎性损伤，这在剖检仔猪有心包膜略厚及有心包积液得到进一步证明，此结果与刘万玲等研究报道一致8 。随着肺动脉第二心音增强和心脏损伤的进一步发展，感染组仔猪可能出现呼吸困难或心力衰竭，均提示在PRRSV感染仔猪的治疗过程中应关注和改善心脏功能状态。2024年第2 期该研究中，感染PRRSV仔猪初期的心脏听诊音变化虽然较为轻微，但病理切片结果显示，PRRSV感染已造成仔猪心脏的组织损伤。在PRRSV感染第3天时，仔猪心肌组织显著充血和淋巴细胞浸润，并有颗粒性变性和肌纤维断裂。Rossow等报道9,PRRSV感染2 1d时仔猪心肌细胞间和血管周围出现淋巴细胞聚集，认为PRRSV感染仔猪的心脏损伤发生较晚；荣福龙研究显示10 1,高致病性PRRSVHuN4毒株感染3d时可见心肌组织淤血，7 d可见淋巴细胞浸润，而经传6 5代致弱的毒株则不会引起这些变化。该研究与前述报道结果差异的原因是否与所用PRRSV毒株有关尚需要进一步研究。需要注意的是，在PRRSV感染引起的心肌组织白细胞浸润中，几乎未见中性粒细胞，而PRRSV却能引起中性粒细胞在肺组织的大量聚集111,这提示,PRRSV对仔猪心脏与肺脏的损伤可能存在不同的机制。感染仔猪心脏组织中PRRSV抗原的存在已在诸多文献中报道。方桂友等报道12 ，在心、肝、脾等14种器官组织中均检测到了PRRSV抗原；RossoW等以ATCCVR2332毒株感染无菌仔猪，在心脏巨噬细胞和微动脉内皮细胞上检测到了病毒抗原13。该研究结果也再次证明,PRRSV存在于心肌组织，不仅分布于心肌细胞，也普遍存在于毛细血管内皮细胞。PRRSV对心肌组织毛细血管内皮细胞的损伤会引起充血、出血、白细胞渗出等血管病变，这表明该病毒引起的仔猪心脏组织损伤应与其引起的血管内皮细胞受损密切相关，在治疗中应重视对血管内皮细胞的保护和功能调控。在PRRSV感染较早时期，即对心脏功能和心肌组织造成了损伤，出现第二心音增强和心包拍水音等心脏听诊音变化，及心肌组织淤血和淋巴细胞浸润等病理变化,提示在对该病毒病的治疗中应注意加强对心脏功能保护，防止病情恶化，降低死亡率。李汉奇等：人工感染PRRSV仔猪心脏的临床表现和病理变化疫,2 0 2 0,37(11):10 4-111.E 5J REZKALLA S H,KLONER R A.Viral myocarditis:19172020:From the Influenza A to the COVID-19 pandemics J.Trends Cardiovasc Med,2021,31(3):163-169.61文刘万铃，余树民，徐志文，等.PRRSVSC-1株在人工感染仔猪体内的分布J.动物医学进展，2 0 10，31（7）：36-387ROSSOW K D,COLLINS J E,GOYAL S M,et al.Pathogen-esis of porcine reproductive and respiratory syndrome virusinfection in gnotobiotic pigs J.Vet Pathol,1995,32(4):361-373.8 刘万铃，余树民，徐志文，等.PRRSVSC-1株在人工感染仔猪体内的分布J.动物医学进展，2 0 10，31（7）：36-38.9 ROSSOW K D,COLLINS J E,GOYAL S M,et al.Pathogen-esis of porcine reproductive and respiratory syndrome virusinfection in gnotobiotic pigsJJ.Vet Pathol,1995,32(4):361-373.10 荣福龙.高致病性PRRSV在仔猪体内动态分布和体外增殖特性的研究D.哈尔滨：东北农业大学，2 0 11.11 刘杰.中性粒细胞在PRRSV感染猪肺损伤中的作用以及移植猪肺PRRSV感染模型的构建D.武汉：华中农业大学，2 0 2 0.12方桂友，王隆柏，庄向生，等。变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒在人工感染猪体内分布情况J.福建农业学报，2 0 11，2 6(3):329-334.13IROSSOW K D,BENFIELD D A,GOYAL S M,et al.Chrono-logical immunohistochemical detection and localization of por-cine reproductive and respiratory syndrome virus ingnotobiotic pigs JJ.Vet Pathol,1996,33(5):551-556.65参考文献：1J SUN Q,XU H,AN T,et al.,Recent progress in studies ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus 1 inChina JJ.Viruses,2023,15(7):1528.2 GRAY D K,DVORAK CMT,ROBINSON S R,et al.Charac-terization of age-related susceptibility of macrophages to por-cine reproductive and respiratory syndrome virus J.VirusRes,2019,263:139-144.3 DOESCHL-WILSON A 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