基因工程的基本操作程序选修市公开课一等奖百校联赛获奖课件.pptx
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1、1.2 1.2 基因工程基本操作程序基因工程基本操作程序第1页 目标基因获取目标基因获取 基因表示载体构建(基因表示载体构建(关键关键)将目基因导入受体细胞 目标基因检测与判定目标基因检测与判定四四 个个 步步 骤骤第2页一、目标基因获取一、目标基因获取(一)、目基因主要是_编码蛋白质基因编码蛋白质基因(二)、获取目标基因惯用方法(二)、获取目标基因惯用方法从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增人工合成人工合成第3页1)1)基因文库?基因文库?1.从基因文库中获取目基因将含有将含有某种生物某种生物不一样基因许多不一样基因许多DNADNA片断,片断,导入到导入到受体
2、菌受体菌群体中,各个受体菌分别含有群体中,各个受体菌分别含有这种生物不一样基因,称为基因文库这种生物不一样基因,称为基因文库2)2)基因文库种类基因文库种类:种种类类基因组基因组DNA文库:文库:含有一个生物含有一个生物全部全部基因基因部分基因文库:部分基因文库:只包含了一个生物只包含了一个生物部分部分基因,基因,如:如:cDNA文库文库第4页受体菌整个群体包含了这种生物全部基因受体菌整个群体包含了这种生物全部基因基因组文库构建模式图基因组文库构建模式图第5页cDNA文库构建模式图文库构建模式图 杂交双链杂交双链(单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转
3、录酶双链双链DNADNA(cDNAcDNA)某种生物某种生物mRNAmRNA某种酶某种酶DNADNA聚合酶聚合酶与载体连接后导入受体菌贮存,组成与载体连接后导入受体菌贮存,组成cDNAcDNA文库文库第6页思索:思索:怎样从基因文库中得到我们所需目标基因呢?怎样从基因文库中得到我们所需目标基因呢?基因核苷酸序列基因核苷酸序列基因功效基因功效基因在染色体上位置基因在染色体上位置基因转录产物基因转录产物mRNA基因表示产物蛋白质基因表示产物蛋白质依据基因依据基因相关信息相关信息第7页概念:概念:PCRPCR全称为全称为_,是一项在生物,是一项在生物_复制复制_核酸合成技术。核酸合成技术。多聚酶链式
4、反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段(2)利用PCR技术扩增目基因过程过程第8页变性变性复性复性延伸延伸第9页1.1.变性变性(90-90-9595)双链双链DNADNA模板模板在热作用下,在热作用下,_断裂,形成断裂,形成_氢键氢键单链单链DNADNA2.2.复性复性 (55-65)(55-65)温度降低,温度降低,与与DNADNA模板结合,形成模板结合,形成局部局部_。双链双链引物引物3.3.延伸延伸(70-7570-75)在在 作用下,从作用下,从引物引物 连接连接 ,合,合 成与模板互补成与模板互补DNADNA链。链。33端端脱氧核苷酸脱氧核苷酸TaqTaq酶酶第10
5、页2 2、详细过程、详细过程第11页原理:原理:.DNADNA复制原理复制原理已知基因核苷酸序列已知基因核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸1 1对引物对引物DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶)条件条件模板模板原料原料酶酶引物引物能量能量第12页PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制比较复制比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不一样点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶高温下变性解旋高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制(PCR扩增仪扩增仪内内)主要在细胞核内主
6、要在细胞核内热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶(Taq酶)酶)大量大量DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子解旋酶、解旋酶、普通普通DNADNA聚合酶等聚合酶等第13页3.3.人工合成人工合成1)1)反转录法:反转录法:杂交双链杂交双链(单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA双链双链DNADNA(cDNAcDNA)目标基因目标基因mRNAmRNA某种酶某种酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶第14页2)2)依据已知氨基酸序列合成依据已知氨基酸序列合成DNADNA法法 :蛋白质氨基酸序列蛋白质氨基酸序列mRNAmRNA核苷酸序列核苷酸序列基因脱氧核苷酸序列基
7、因脱氧核苷酸序列推测推测推测推测目基因化学合成化学合成第15页二、基因表示载体构建(二、基因表示载体构建(关键关键)使目基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代使目基因能够表达和发挥作用1 1、基因、基因表示载体表示载体构建目标构建目标?(?(P11P11)第16页2 2、基因表示载体组成?、基因表示载体组成?开启子开启子目基因终止子终止子标识基因标识基因1 1、开启子?终止子?标识基因?它们作用是?、开启子?终止子?标识基因?它们作用是?2、作为基因工程表达载体,只需含有目基因就可以完成任务吗?3 3、基因表示载体构建是千篇一律吗?基因表示载体构建是千篇一律吗?第17页三、将目基因导入
8、受体细胞目标基因进入目标基因进入_ _内,而且在受体内,而且在受体细胞内维持细胞内维持_ _ _和和_ _过程过程转化转化:受体细胞受体细胞稳定稳定表示表示第18页1 1、将目标基因导入植物细胞方法:、将目标基因导入植物细胞方法:易感染易感染双子叶植物双子叶植物和和裸子植物裸子植物,对大多数单,对大多数单子叶植物没有感染能力子叶植物没有感染能力原理:原理:Ti质粒上质粒上T-DNA(可转移(可转移DNA)能够转移到受体细胞,而且整合到受体细能够转移到受体细胞,而且整合到受体细胞染色体胞染色体DNA上。上。农杆菌特点:农杆菌特点:(1)农杆菌转化法)农杆菌转化法(采取最多)第19页两次拼接?两次
9、导入?两次拼接?两次导入?组织培养技术组织培养技术第20页(2 2)基因枪法)基因枪法(3 3)花粉管通道法)花粉管通道法第21页 显微注射技术(最惯用,最有效)显微注射技术(最惯用,最有效)(3)将目基因导入动物细胞方法方法受体细胞受体细胞惯用受精卵惯用受精卵动物细胞受精卵全能性大动物细胞受精卵全能性大目标基因表示载体提纯目标基因表示载体提纯取卵(受精卵)取卵(受精卵)显微注射显微注射受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物过程:过程:第22页(2)将目基因导入微生物细胞过程:过程:Ca2+处理受体细胞处理受体细胞感受态细胞感受态细胞重组表示载体与感受态细胞混合重组表示载体与感受态细胞混合感
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