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化学发光法的原理技术要点和评价应用省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、 化学发光免疫技术化学发光免疫技术第一节第一节 发光与化学发光剂发光与化学发光剂第二节第二节 发光酶免疫测定(发光酶免疫测定(C CLEIALEIA)(chemiluminescence enzyme chemiluminescence enzyme immunoasssayimmunoasssay)第三节第三节 化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)(chemiluminescence immunoassaychemiluminescence immunoassay)第四章第四章 电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLI)ECLI)(electroch
2、emiluminescence immunoassay)(electrochemiluminescence immunoassay)第1页 化学发光免疫技术:化学发光免疫技术:集灵敏化学集灵敏化学 发光分析和特异抗原抗体免疫测发光分析和特异抗原抗体免疫测 定于一体检测技术。定于一体检测技术。概概 念念 特点:特点:特异性高、敏感性高、分离简便、特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。可自动化。第2页化学发光免疫技术类型化学发光免疫技术类型 按发光剂不一样分为按发光剂不一样分为 1.1.发光酶免疫测定(发光酶免疫测定(C CLEIALEIA)c
3、hemiluminescence enzymeimmunoasssay chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.2.化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)chemiluminescence immunoassay chemiluminescence immunoassay 3.3.电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLI)ECLI)electrochemiluminescence immunoassay electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不一样分按分离方法不一样分 1
4、.1.微粒子化学发光免疫测定微粒子化学发光免疫测定 2.2.磁颗粒化学发光免疫测定磁颗粒化学发光免疫测定第3页第一节第一节 发光与化学发光剂发光与化学发光剂一、发光一、发光 一个物质由电子激发态回复到基态时,一个物质由电子激发态回复到基态时,释放出能量表现为光发射。释放出能量表现为光发射。1.1.光照发光光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态,当回复至基态时发出较长波长可见光。发态,当回复至基态时发出较长波长可见光。2.2.生物发光生物发光:反应底物在荧光素酶催化下利用反应底物在荧光素酶催化下利用 ATP ATP产能,生成激发态氧化荧光素,后者在回产能
5、,生成激发态氧化荧光素,后者在回 复到基态时多出能量以光子形式放出。复到基态时多出能量以光子形式放出。3.3.化学发光化学发光:在常温下由化学反应产生光发射。在常温下由化学反应产生光发射。化学发光是一个多步骤过程。化学发光是一个多步骤过程。第4页 荧光素酶荧光素酶ATP;O2;Mg2+氧化萤火虫荧光素氧化萤火虫荧光素萤火虫荧光素萤火虫荧光素返回返回返回返回光光 +AMP+O2+CO2+第5页化学发光化学发光 机制:机制:一些化合物能够利用化学反应产生能一些化合物能够利用化学反应产生能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态
6、分子衰退至基激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时,以发射光子形式释放能量(即发光)。态时,以发射光子形式释放能量(即发光)。化学发光剂或发光底物:化学发光剂或发光底物:在化学发光反应中参在化学发光反应中参 与能量转移并最终以发射光子形式释放能量与能量转移并最终以发射光子形式释放能量 化合物。化合物。发光剂分为发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂荧光素、生物发光剂、化学发光剂第6页 能参加化学发光反应;能参加化学发光反应;与抗原或抗体偶联后形成稳定结合物试剂;与抗原或抗体偶联后形成稳定结合物试剂;偶联后仍保留高量子效应和反应动力;偶联后仍保留高量子效应和反应动力;应不改变或极少改变
7、被标识物理化特征,应不改变或极少改变被标识物理化特征,尤其是免疫活性。尤其是免疫活性。化学发光剂应符合以下几个条件化学发光剂应符合以下几个条件返回返回返回返回第7页1.1.酶促反应发光底物酶促反应发光底物 是指经酶降解作用而发出光一类发光底物。是指经酶降解作用而发出光一类发光底物。CLEIA CLEIA中惯用酶有中惯用酶有HRPHRP和和APAP HRP HRP发光底物有鲁米诺、对发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸羟基苯乙酸 AP AP发光底物有发光底物有AMPPDAMPPD、4-MUP4-MUP(荧光底物)(荧光底物)特点:可作标识物、也可作过氧化物酶底物特点:可作标识物、也可作过氧化物酶底物
8、 1.1 1.1 鲁米诺鲁米诺H2O2/OH HRP+N2+H2O+光光第8页对对-羟基苯乙酸(羟基苯乙酸(HPAHPA)HPA HPA在在H H2 2O O2 2存在下被存在下被HRPHRP氧化成氧化二聚体(荧光氧化成氧化二聚体(荧光 物质),在物质),在350nm350nm激发光作用下,发出激发光作用下,发出450nm450nm波长波长 荧光,可用荧光光度计测量。荧光,可用荧光光度计测量。1.2 HPA 1.2 HPAH2O2HRP+荧荧 光光氧化二聚体氧化二聚体第9页AMPPDAMPPD AMPPD AMPPD在碱性条件下,被在碱性条件下,被APAP酶解生成相当稳定酶解生成相当稳定 AM
9、P-D AMP-D阴离子,其有阴离子,其有2 230min30min分解半衰期,发分解半衰期,发 出波长为出波长为470nm470nm连续性光,在连续性光,在15min15min时其强度时其强度 到达高峰,到达高峰,151560min60min内光强度保持相对稳定。内光强度保持相对稳定。光光AP/OH HPO4 2 1.3 AMPPD 1.3 AMPPD第10页4-MUP4-MUP 4-MUP 4-MUP被被APAP催化生成催化生成4-4-甲基伞形酮,在甲基伞形酮,在360nm360nm 激发光作用下,发出激发光作用下,发出448nm448nm荧光,可用荧荧光,可用荧 光光度计进行测量。光光度
10、计进行测量。荧荧光光AP 1.4 4-MUP 1.4 4-MUP4-MU4-MU360nm360nm激发光激发光H H3 3POPO4 4+第11页2.2.直接化学发光剂直接化学发光剂特点:特点:不需催化剂,只需改变溶液不需催化剂,只需改变溶液pHpH等条件等条件 就能发光物质。反应快速、背景低、就能发光物质。反应快速、背景低、信比高,发光量与信比高,发光量与AEAE浓度呈线性关系。浓度呈线性关系。惯用试剂:惯用试剂:吖啶酯(吖啶酯(acridinium,AEAE)+CO+CO2 2+光光第12页3.3.电化学发光剂电化学发光剂 是指经过在电极表面进行电化学反应而发出是指经过在电极表面进行电化
11、学反应而发出 光物质。光物质。特点:特点:反应在电极进行;反应在电极进行;电子供体为:三丙胺(电子供体为:三丙胺(TPATPA)化学发光剂:三联毗啶钌化学发光剂:三联毗啶钌返回返回返回返回三联毗啶钌三联毗啶钌分子结构图分子结构图第13页第二节第二节 发光酶免疫测定发光酶免疫测定(CLEIA)一、原理一、原理 属于酶免疫测定一个。只是最终一属于酶免疫测定一个。只是最终一 步酶反应所用底物为发光剂,经过发光反应步酶反应所用底物为发光剂,经过发光反应 发出光在特定仪器上进行测定。发出光在特定仪器上进行测定。二、技术类型二、技术类型 依据酶促反应底物不一样可分为:依据酶促反应底物不一样可分为:1.1.
12、荧光酶免疫测定技术荧光酶免疫测定技术 2.2.化学发光酶免疫测定技术化学发光酶免疫测定技术 依据免疫学反应模式分依据免疫学反应模式分 1.1.双抗体夹心法和双抗原夹心法双抗体夹心法和双抗原夹心法 3.3.固相抗原竞争法:固相抗原竞争法:第14页荧光酶免疫测定技术反应原理图荧光酶免疫测定技术反应原理图 洗涤洗涤弃上清弃上清 是利用理想酶荧光底物,生成产物稳定并有是利用理想酶荧光底物,生成产物稳定并有 强荧光强度,经过测定荧光强度进行定量。强荧光强度,经过测定荧光强度进行定量。第15页化学发光酶免疫测定技术反应原理图化学发光酶免疫测定技术反应原理图 洗涤洗涤弃上清弃上清 是利用酶对发光底物催化作用
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