化学检测专业知识讲座省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、第七章 化学检测技术1第1页化学检测技术特点:化学检测技术特点:依据物质化学性质而对物质进行定量、定性测定。应用最早、最广泛检测技术简便、快速、操作轻易2第2页一.序言n化学检测是依据物质化学性质而对物质进行定性、定量测定方法,主要包含:1.糖类化学检测 2.蛋白质化学定量检测 3.蛋白质氨基酸序列检测 4.蛋白质免疫化学检测 5.核酸化学检测3第3页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 定义和分类定义和分类 碳水化合物统称为糖类,是由碳、氢、氧三种碳水化合物统称为糖类,是由碳、氢、氧三种元素组成一大类化合物。元素组成一大类化合物。糖类包含多糖、双糖、单糖单糖和一些双糖含有游离羰基还原糖多糖
2、和蔗糖等无还原性非还原糖糖类化学检测主要是利用游离羰基还原性质,与试剂(氧化剂)进行氧化还原反应而进行测定。非还原糖必须转化为还原糖再进行测定4第4页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 糖类物质测定方法糖类物质测定方法 相对密度法相对密度法折光法折光法 旋光法旋光法物理法物理法 物理法物理法 化学法化学法 色谱法色谱法 发酵法发酵法 酶酶 法法 重量法重量法5第5页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 直接滴定法直接滴定法 (改良改良兰兰爱农法爱农法)高锰酸钾法高锰酸钾法 萨氏法萨氏法 3,5二硝基水杨酸二硝基水杨酸 酚酚硫酸法硫酸法 蒽酮法蒽酮法 半胱氨酸半胱氨酸咔唑法咔唑法化学法化学
3、法还原糖法还原糖法碘量法碘量法比色法比色法糖类检测化学法糖类检测化学法6第6页1.兰爱农法n此法以次甲基蓝为指示剂,直接用糖液滴定到斐林试剂中进行测定;或者将糖液加到斐林试剂中,再用标准葡萄糖液反滴定。又称置换法,直接滴定法或者次甲基蓝法。8第8页n1.1原理 糖液滴到斐林试剂中时,还原糖中游离羰基与酒石酸钾钠铜反应,使二价铜离子还原生成一价氧化亚铜沉淀。因为次甲基蓝氧化能力比二价铜弱,当二价铜离子全部被还原后,过量一滴还原糖马上使次甲基蓝还原,溶液蓝色消失,从而显示反应终点。9第9页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 还原糖测定还原糖测定方法方法兰爱农(Lane-Eynon)法:斐林试剂
4、甲液:硫酸铜斐林试剂甲液:硫酸铜+次甲基蓝次甲基蓝 斐林试剂乙液:酒石酸钾钠斐林试剂乙液:酒石酸钾钠+NaOH+NaOH+亚铁氰化钾亚铁氰化钾 乙酸锌溶液乙酸锌溶液 亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液 葡萄糖标准溶液:准确称取经葡萄糖标准溶液:准确称取经 98 98 100 100 干燥至恒重干燥至恒重无水葡萄糖,加水溶解后移入无水葡萄糖,加水溶解后移入1000 m11000 m1容量瓶中,加入容量瓶中,加入5m15m1盐酸盐酸(预防微生物生长预防微生物生长)。10第10页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 操作关键点操作关键点(1)斐林试剂标定(a)标定预备试验 A、B各5mL10mL水(25
5、0mL三角瓶中)摇匀,加热至沸腾,2滴1次甲基蓝溶液,用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失,耗标准葡萄糖液(0.1或0.2)V1mL。(b)标定 A、B各5mL10mL水(250mL三角瓶中)摇匀,从滴定管中预先加入(V1-1)mL标准葡萄糖液,摇匀后加热加热至沸腾,2滴1次甲基蓝溶液,用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失(滴定在1min内完成),统计消耗标准葡萄糖液总毫升数V011第11页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 (2)定糖(a)定糖预备试验A、B各5mL10mL样品糖液(250mL三角瓶中)摇匀,加热至沸腾,2滴1次甲基蓝溶液,用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失,耗标准葡萄糖液(0.1或0.2)V
6、2mL。(b)定糖A、B各5mL10mL样品糖液(250mL三角瓶中)摇匀,补加(V0-V2)mL水,并从滴定管中预先加入(V2-1)mL标准葡萄糖液,摇匀后加热加热至沸腾,2滴1次甲基蓝溶液,用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失(滴定在1min内完成),统计消耗标准葡萄糖液总毫升数V12第12页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 (3)计算还原糖含量(以葡萄糖计)(V0-V)c (1/10)n注意:(a)AB分开储存,预防Cu+改变,临用混合(b)单标移液管吸液准确,外壁也需擦洁净(c)体积需控制在一定范围内,对pH有影响(d)煮沸时间要一致(e)注意指示剂加入时间和加入量一致(f)滴定速度一致
7、(后滴定0.51mL,1min内完成)(g)产物Cu2O不稳定,次甲基蓝变色也不稳定,暴露于空气或沸腾颜色改变,滴定过程不能摇动,不可中途中止加热 13第13页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 斐林试剂快速法:斐林试剂快速法:在斐林试剂中加入亚铁氰化钾(黄血盐)反应终点为蓝色消失,淡黄色出现。反应终点比兰爱农法更为显著。其特点是试剂用量少,操作和计算都比较简便、其特点是试剂用量少,操作和计算都比较简便、快速,滴定终点显著。快速,滴定终点显著。14第14页n2.2试验操作 2.2.1斐林试剂标定 吸收斐林甲、乙液各5ml,置于250ml三角瓶内,加10ml水,从滴定管中预先加入约20ml0
8、.1标准葡萄糖液,摇匀后于电炉上加热至沸,马上用标准葡萄糖液继续滴定至蓝色消失。统计消耗葡萄糖液总毫升数V0。15第15页n2.2.2 样品含糖量测定 吸收斐林甲、乙液各5ml,置于250ml三角瓶内,加入样品稀释液10ml,及适量0.1标准葡萄糖液。摇匀后按标定时相同操作进行。统计消耗标准葡萄糖液毫升数(V)。16第16页n2.2.3 计算还原糖含量()(V0-V)*c*N/10 式中,V0斐林试剂标定值,ml V样品糖液测定值,ml c标准葡萄糖液浓度,g/ml 10样品液体积,ml N样品稀释倍数17第17页3.碘量法3.1 原理 此法是利用碘与氢氧化钠反应生成次碘酸钠,氧化还原糖自由醛
9、基,过量碘再用硫代硫酸钠滴定,从而测定糖含量。次碘酸钠氧化能力比较弱,所以只适合用于醛糖滴定,与酮糖不起反应。18第18页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 I2 NaIO(氧化剂),其氧化能力较弱,仅适合用于醛糖测定,与酮糖不起反应操作关键点:(1)标准硫代硫酸钠溶液配制,0.05 mol/L,沸腾后冷却水配制,存放在棕色瓶中,一周后用标准重铬酸钾标定。(2)标准碘液配制,0.1mol/L(3)空白滴定:空白液,用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘醛糖醛糖+I2+3 NaOH=醛糖酸钠醛糖酸钠+2 NaI+2H2OI2+2 NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO +NaI+2 HCl=I2+
10、2 NaCl+H2O19第19页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 碘量瓶中,10mL0.1mol/L碘液15mL0.1 mol/LNaOH5mL空白液,摇匀后暗反应15min1mL1mol/L硫酸溶液,用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色,加0.2mL0.5淀粉液作指示剂,滴定至蓝色消失,统计V0(4)样品滴定:以5mL样品液代替空白液,V1(5)计算:醛糖含量(V0 V1)C M n注意:暗反应后需酸化再滴定,滴定时开始轻摇(碘挥发),后再摇(淀粉吸附碘)配合次甲基蓝法测定一些糖含量(假如糖)配合次甲基蓝法测定一些糖含量(假如糖)20第20页4.铜试剂法n4.1 原理 铜试剂提供
11、二价铜离子和碘,还原糖与二价铜离子反应生成氧化亚铜被碘氧化,再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩下碘,从而测定样品中还原糖含量。铜试剂中适当增加或降低硫酸铜和碘酸钾量,就可测定不一样范围糖含量。21第21页n4.2 试验操作 4.2.1 铜试剂配制 4.2.2 标准曲线制作:4.2.2.1 配制葡萄糖标准液 4.2.2.2 取6个三角瓶,分别加入0、1、2、3、4、5ml标准葡萄糖液和5、4、3、2、1、0ml蒸馏水。4.2.2.3 各瓶加入5ml铜试剂。置于沸水浴中加热10min,冷却至室温。22第22页4.2.2.4 加入0.5mol/L硫酸5ml,振荡。待红色氧化亚铜沉淀完全溶解后,马上用0.0
12、05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色,加数滴淀粉指示剂,继续滴定至蓝色消失。统计所用硫代硫酸钠毫升数。4.2.2.5 以葡萄糖含量为纵坐标,以空白滴定值减去标准样品滴定值得出硫代硫酸钠毫升数为横坐标,绘标准曲线。4.2.3 样品含糖量测定 将还原糖样品液适当稀释,取5ml样品液代替标准葡萄糖液,按上述方法进行测定。测样品中总糖含量,则样品经过水解后,按还原糖含量测定方法进行测定。测淀粉或半纤维素含量时,水解后测定还原糖量要乘上系数0.9。23第23页5.比色法测糖 上述4种糖检测方法都是经过滴定方法进行糖含量测量;另外,我们还能够经过比色法等检测糖含量,主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和DNS
13、法等,其原理分别以下:24第24页n5.1苯酚-硫酸法原理 苯酚硫酸法主要用于多糖检测。其原理是:多糖在浓硫酸作用下水解成单糖,并快速脱水生成糠醛衍生物,随即与苯酚结合生成有色化合物,从而能够利用分光光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品中多糖含量。n5.2 蒽酮-硫酸法原理 非还原性糖在浓硫酸催化下,快速水解为还原糖。还原糖与浓硫酸作用形成5-羟甲基糠醛,5-羟甲基糠醛,与蒽酮反应生成蓝绿色物质,在625nm处有最大吸收值。25第25页n5.3 DNS法原理 3,5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物3-氨基-5-硝基水杨酸,在一定范围内,
14、还原糖量和反应液颜色呈正比。26第26页5.4 DNS法测发酵残糖5.4.1 标准曲线绘制 预先配制好1mg/ml葡萄糖标准液。取6支具塞比色管,编号,分别吸收0、0.2、0.4、0.6、0.8及1ml葡萄糖标准液,再补充蒸馏水至2ml,分别添加DNS试剂3ml。将各管溶液混合均匀,在预先加热好沸水中加热5min,取出马上用自来水冷却至室温,再向每管补充蒸馏水至25ml,小心摇匀。在分光光度计上,测520nm波优点溶液OD值。以葡萄糖mg数为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线。27第27页5.4.2 发酵残糖测定 准确吸收已分离菌体后发酵液1ml,用蒸馏水稀释至适当倍数得到稀释液。准确吸收稀
15、释液1ml,按照5.4.2中方法测定OD值,依据DNS法标准曲线和稀释倍数计算发酵液残糖含量。28第28页 注意事项:a.试验中OD值最好在0.20.8范围内。发酵液中残糖比较高,所以可能需要进行预备试验,依据试验结果对发酵液进行适当稀释。b.发酵液和其它试剂在具塞试管内要充分混合均匀。c.沸水浴时间要严格掌握好,时间过长会使溶液颜色加深,试验误差变大。29第29页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 蔗糖是葡萄糖和果糖组成双糖,没有还原蔗糖是葡萄糖和果糖组成双糖,没有还原性,不能用碱性铜盐试剂直接测定,但在一定条性,不能用碱性铜盐试剂直接测定,但在一定条件下,蔗糖可水解为含有还原性葡萄糖和
16、果糖件下,蔗糖可水解为含有还原性葡萄糖和果糖(转化糖)。所以,能够用测定还原糖方法测定(转化糖)。所以,能够用测定还原糖方法测定蔗糖含量。对于纯度较高蔗糖溶液,其相对密度、蔗糖含量。对于纯度较高蔗糖溶液,其相对密度、折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度都有一定折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度都有一定关系,故也可用物理检验法测定。这里介绍还原关系,故也可用物理检验法测定。这里介绍还原糖法。糖法。蔗糖测定蔗糖测定30第30页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 淀粉测定方法有各种,部分是依据淀粉理化性淀粉测定方法有各种,部分是依据淀粉理化性质而建立。惯用方法有:质而建立。惯用方法有:酸水解法酸水
17、解法 酶水解法酶水解法 旋光法旋光法 酸化酒精沉淀法。酸化酒精沉淀法。淀粉测定方法淀粉测定方法31第31页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 酸水解法酸水解法 (一)(一)原理原理 样品经乙醚除去脂肪,乙醇除去可溶性糖类后,用盐酸水解淀粉为葡萄糖,按还原糖测定方法测定还原糖含量,再折算为淀粉含量。淀粉水解 于250m1锥形瓶中加入30 ml 6 mol/L盐酸,装上冷凝管,置沸水浴中回流 2 h,速冷。蔗糖水解:于250m1锥形瓶中加入5 ml 6 mol/L盐酸,置6870水浴中15 min,速冷。32第32页第一节第一节 糖类化学检测糖类化学检测 酶水解法酶水解法(一)(一)原理:原理
18、:含淀粉含淀粉 糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖 葡萄糖葡萄糖样品样品酸解液化糖化酸解淀粉酶水解有选择性33第33页二.蛋白质和氨基酸定量检测n蛋白质定性定量分析是生物化学和其它生物学科、食品检验、临床检验诊疗疾病、生物药品分离提纯和质量检验中最惯用伎俩。34第34页第二节第二节 蛋白质与氨基酸化学检测蛋白质与氨基酸化学检测 (1 1)一切蛋白质都含)一切蛋白质都含N N元素,且各种蛋白质含元素,且各种蛋白质含氮量很靠近,平均为氮量很靠近,平均为1616;(2 2)蛋蛋白白质质系系数数:任任何何生生物物样样品品中中每每1g1g元元N N存存在在,就就表表示示大大约约有有100/16=6.25100/1
19、6=6.25蛋蛋白白质质存存在在,6.256.25常称为蛋白质常数常称为蛋白质常数100克样品中蛋白质含量克样品中蛋白质含量(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%蛋白质元素组成特点:蛋白质元素组成特点:35第35页第二节第二节 蛋白质与氨基酸化学检测蛋白质与氨基酸化学检测 含氮量 每gN相当P肉、蛋、豆 16 6.25 面粉 17.6 5.70 奶品 15.7 6.38 花生 18.2 5.50 鲑精蛋白 31.5 3.1736第36页1.凯氏定氮法n1.1 原理 将样品与浓硫酸共热时蛋白质分解,其中氮与硫酸反应生成硫酸胺,然后碱化蒸馏使氨游离。氨由硼酸吸收生成硼
20、酸铵以标准酸滴定。从而能够计算出含氮量。滴定时以甲基红-溴甲酚绿混合液为指示剂,滴至溶液变为紫红色即为终点。也可用标准酸吸收氨,再用标准碱滴定剩下酸。(甲基橙为指示剂,黄色为终点)37第37页常量凯氏定氮装置38第38页微量凯氏定氮装置简图39第39页微量凯氏定氮装置40第40页n1.2 试验操作 1.2.1 样品处理 固体样品应在105干燥至恒重。液体样品可直接吸收一定量或者稀释后吸收一定量进行测定,应该使样品含氮量在0.21.0mg范围内。41第41页n1.2.2 消化 取一定量样品,于50ml干燥凯氏烧瓶内。加入300mg硫酸钾硫酸铜混合粉末,再加入3ml浓硫酸。电炉加热,在通风橱中消化
21、,瓶口加一小漏斗,先以文火加热防止泡沫飞溅,不能让泡沫上升到瓶颈,待泡沫停顿发生后,加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全,直到消化液清澈透明。另取凯氏烧瓶一个,不加样品,其它操作相同,作空白对照。42第42页n1.2.3 蒸馏n将微量凯氏蒸馏装置洗涤洁净。将凯氏烧瓶内消化液冷却后,全部转入100ml容量瓶中。凯氏烧瓶用蒸馏水洗涤三次,洗涤液全部转入容量瓶内,再用蒸馏水定容。n 吸收20ml稀释消化液,置于蒸馏装置反应室中,加10ml30氢氧化钠溶液,将玻璃塞塞紧,漏斗中加少许蒸馏水作为水封。n取一三角瓶,加入10ml硼酸田氏指示剂混合液,置于冷凝管下口,冷凝管口浸没在硼酸液面
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