南农生物分离工程生物分离7亲和省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、亲和层析亲和层析第1页生物亲和作用n生物亲和作用本质n影响亲和作用原因n亲和作用体系第2页 生物亲和作用本质n生物分子间特异性相互作用称为生物亲和作用(bioaffinity)或简称亲和作用(affinity)。n利用生物分子间这种特异性结合作用原理进行生物物质分离纯化技术称为亲和纯化(affinity purification)。n亲和作用分子(物质)对能够是:大分子-小分子,大分子-大分子,大分子-细胞,细胞-细胞。第3页 第4页 配基固定化、吸附样品、样品解吸配基固定化、吸附样品、样品解吸“亲和吸附剂亲和吸附剂”:载体与固定化配基总称:载体与固定化配基总称第5页n含有亲和作用分子对之间含
2、有“钥匙”和“锁孔”空间结构关系。n亲和结合作用,最少存在3个对应官能团相结合:n静电作用 n氢键 n疏水相互作用n配位键 n弱共价键 图5-1 蛋白质结合部位及各种结合作用力第6页 亲和作用体系 n将亲和体系中一个分子与固体粒子共价偶联,可特异性结合另一个分子(目标产物),使其从混合物中高选择性地分离纯化。n普通将被固定分子称为其亲和结合对象配基(ligand),用L表示。nKeq越大,亲和结合作用越强。Keq普通为104108 L/mol,最高可到达1015 L/mol。第7页惯用亲和作用体系惯用亲和作用体系特异性特异性 亲和作用体系亲和作用体系高特异性高特异性 抗原抗原-单克隆抗体单克隆
3、抗体 荷尔蒙荷尔蒙-受体蛋白受体蛋白 核酸核酸-互补碱基链段、核酸结合蛋白互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶酶-底物、产物、抑制剂底物、产物、抑制剂群特异性群特异性 免疫球蛋白免疫球蛋白-A蛋白、蛋白、G蛋白蛋白 酶酶-辅酶辅酶 凝集素凝集素-糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质酶、蛋白质-肝素肝素 酶、蛋白质酶、蛋白质-活性色素(染料)活性色素(染料)酶、蛋白质酶、蛋白质-过分金属离子过分金属离子 酶、蛋白质酶、蛋白质-氨基酸(组氨酸等)氨基酸(组氨酸等)第8页 亲和色谱 n亲和色谱特点 选择性高、特异性极强,以胰岛素提取胰岛素受体,一步纯化8000倍 分离精
4、度高:可用于分离含量极低,结构相分离精度高:可用于分离含量极低,结构相近化合物近化合物n亲和色谱不足通用性差,洗脱条件苛刻费用高第9页 亲和色谱填料n亲和吸附作用是在特定配基存在下实现,需依据目标产物选择适当亲和配基修饰固定相粒子,制备所需亲和吸附介质。n少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴刀豆球蛋白A(一个植物凝集素)。n在利用亲和色谱技术纯化目标产物时,商品化亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物需要,有必要自制亲和吸附介质。第10页 亲和配基亲和配基n配基选择配基选择 足够大亲和力足够大亲和力 结合专一结合专一 牛胰蛋白酶抑制剂牛胰蛋白酶抑制剂:除与牛胰蛋白酶除与牛胰蛋白酶,还与
5、胰凝还与胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶有亲和作用乳蛋白酶、激肽释放酶有亲和作用 配基有化学活性配基有化学活性 第11页n配基浓度配基浓度 亲和势较低(亲和势较低(KL 10-4mol/L),增加配基浓度),增加配基浓度或增加柱长或增加柱长 大分子配基浓度过高,活性中心相互掩盖,大分子配基浓度过高,活性中心相互掩盖,吸附强,非专一性吸附吸附强,非专一性吸附 理想配基浓度理想配基浓度1-10mol/L,2 mol/L凝胶凝胶 n配基分子大小配基分子大小 首选大分子或插入首选大分子或插入“手臂手臂”第12页n偶联位置偶联位置 e结合有效,结合有效,偶联位置造成偶联位置造成 亲和力差异,可吸附不一样配体亲和
6、力差异,可吸附不一样配体 第13页n亲和配基1.酶抑制剂 n小分子抑制剂有苄脒(benzamidine)、精氨酸和赖氨酸等。底物底物,亲和力抑制剂,专一性较差,亲和力抑制剂,专一性较差,转变为产物,用不适转变为产物,用不适pH,缺乏辅因子,缺乏辅因子 辅酶辅酶:专一性不强:专一性不强 第14页2.抗体n利用抗体为配基亲和色谱又称免疫亲和利用抗体为配基亲和色谱又称免疫亲和色谱(色谱(immunoaffinity chromatography)。抗体与抗原之间)。抗体与抗原之间Keq普通为普通为1071012 L/mol。n利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物
7、大分子有效伎俩。类生物大分子有效伎俩。第15页3.A蛋白nprotein A为分子量约42 kD蛋白质,与IgG含有很强亲和作用,结合部位为IgG分子Fc片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。n不一样IgGFc片段结构非常相同,所以A蛋白可作为各种抗体亲和配基,但不一样抗体结合常数有所不一样。nA蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原结合能力,所以A蛋白也可用于分离抗原-抗体免疫复合体。第16页4.凝集素n凝集素(lectin)是与糖特异性结合蛋白质(酶和抗体除外)总称。n伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,con A)可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子分析、纯化。npH5.
8、6时con A为二聚体,分子量为52 kD;pH5.6时为四聚体,分子量为102 kD,两个亚基(subunit)之间经过二硫键结合。n在利用con A为配基亲和色谱操作中,操作条件应该适宜。第17页5.辅酶和磷酸腺苷n脱氢酶和激酶与辅酶之间含有亲和结合作用。辅 酶 主 要 有 NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)、NADP(NAD phosphate)和ATP(adenosine triphosphate)等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶亲和配基。nAMP(adenosine 5-monophosphate)、ADP(adenosine 2,5-diph
9、osphate)腺苷部分与上述辅酶结构类似,可用做这些酶亲和配基。第18页6.三嗪类色素n利用色素为配基亲和色谱法又称色素亲和色谱(Dye-ligand affinity chromatography)。nTriazine dyes是一类分子内含有三嗪环合成染料,与NAD结合部位相同,又称为生体模拟色素(biomimetic dye)。除脱氢酶和激酶外,三嗪类色素还与血清白蛋白、干扰素、核酸酶和糖解酶 等含有很高亲和力。nCibacron Blue F3GA:第19页7.过渡金属离子nCu2+,Ni2+,Zn2+和Co2+等过渡金属离子可经过与亚胺二乙酸(IDA)或三羧甲基乙二胺(TED)形成
10、螯合金属盐固定在固定相粒子表面,用做亲和吸附蛋白质配基。n这种利用金属离子为配基亲和色谱普通称为金属螯合色谱(metal chelate chromatography)或固定化金属离子亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)。第20页8.组氨酸 n组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用:静电和疏水性相互作用都有可能参加亲和结合。n在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质pI溶液中,固定化组氨酸亲和吸附作用最强,伴随盐浓度增大,亲和吸附作用降低。第21页9.肝素n肝素(heparin)是存在于哺乳动物肝、肺、肠等脏器中酸性多糖类物质,分子量普通
11、为5至30 kD,含有抗凝血作用。n肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等含有亲和作用,可用作这些物质亲和配基。n肝素亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强,伴随盐浓度增大结合作用降低。第22页n亲和色谱填料载体n亲和色谱理想载体应含有以下特征:不溶性;渗透性;高硬度及适当颗粒形式;最低吸附力;很好化学稳定性;抗微生物和酶侵蚀;亲水性;含有大量供反应化学基团。第23页n常规亲和色谱填料都是以软质凝胶,诸如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等作为载体材料。n近年来,为了满足快速高效分离需要,以多孔硅胶和合成高分子化合物为载体高效AFC色谱填料,得以快速发展。n亲和色
12、谱填料制备过程普通包含:载体(carrier、support)选择、载体活化和配基连接。第24页亲和吸附载体种类亲和吸附载体种类种类组成性能多孔玻璃载体硅酸盐坚硬、耐酸碱、易修饰聚丙烯酰胺凝胶载体丙烯酰胺N,N-亚甲基双丙烯酰胺亲水性好可供活化基团多纤维素载体多糖类物质起源丰富,但非特异性吸附及空间位阻强,对分离不利葡聚糖凝胶载体经环氧氯丙烷交联多糖类理化性质稳定,但粒径太小第25页惯用载体惯用载体 1.纤维素纤维素 活化后带电荷,非特异性吸附强,结构紧密,活化后带电荷,非特异性吸附强,结构紧密,小分子配基亲和位阻大小分子配基亲和位阻大,分离与核酸相关物质(分离与核酸相关物质(oligo)dT
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