PCR原理-PPT.ppt
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1、变性与复性变性与复性PCR原理原理 DNA的变性(denaturation):在某些理化因素作用下,DNA分子内碱基对之间的氢键断裂,使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。解链温度(融解温度,Tm)(melting temperature):使50%的DNA发生变性时的环境温度。DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。增增色效应:色效应:DNA变性后对变性后对260nm紫外光收紫外光收增加增加的现象。的现象。DNA的复性(的复性(renaturation):在适当条件下,变性在适当条件下,变性DNA的两条的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构互补链可
2、再恢复成天然的双螺旋结构的过程。的过程。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复经缓慢冷却后即可复性,此过程称为退火性,此过程称为退火(annealing)。减色效应:减色效应:变性变性DNA复性后复性后对对260nm紫外光紫外光吸收减少的现象吸收减少的现象。1.常用的变性方法:常用的变性方法:热变性热变性 酸碱变性酸碱变性 化学试剂变性化学试剂变性 2.2.影响复性的因素影响复性的因素影响复性的因素影响复性的因素 序序序序 列列列列 简简简简 单单单单 的的的的 分分分分 子子子子 复复复复 性性性性 快快快快,如如如如 poly(dT)poly(dT)和和和和poly(dApoly(dA)
3、识别快识别快识别快识别快 DNA DNA片段愈大,扩散速度愈低,复性慢片段愈大,扩散速度愈低,复性慢片段愈大,扩散速度愈低,复性慢片段愈大,扩散速度愈低,复性慢 离子强度离子强度离子强度离子强度有利于复性有利于复性有利于复性有利于复性 DNA DNA浓度浓度浓度浓度复性复性复性复性 Tm值的估算值的估算 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)%Tm=81.5+16.6lgM+0.41(G+C)%-500/n-0.61(甲酰胺(甲酰胺%)PCRPCR技术技术总论总论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称,是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。
4、聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新,它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。70年代初,Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki(1985)和Mullis(1986)两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后,扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988年,由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶,这是从水生栖热菌(Thermusaquaticus)中提取的耐热DNA聚合酶,简称Taq DNA聚
5、合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性,因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成,使反应产物按指数增长,所以命名为聚合酶链式反应。PCRPCR基本原理基本原理 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶
6、序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟,23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCRPCR原理原理Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extensionPCR productPCR productPCR反应曲线反应曲线标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 4种种dN
7、TP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ulPCRPCR反应五要素反应五要素引物(引物(primer)酶酶(Taq DNA polymerase)dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)模板模板(template)Mg2+(magnesium)引物引物引物是引物是PCR特异性反应的关键特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度互补的程度理论上,只要知道任何一段模板理论上
8、,只要知道任何一段模板DNA序序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,用引物,用 PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大在体外大量扩增量扩增引物设计的原则(一)引物设计的原则(一)引物长度:引物长度:15-30bp,常用为,常用为20mer左右左右引物的有效长度不能大于引物的有效长度不能大于 38 mer,否则最适延伸,否则最适延伸温度会超过温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度(聚合酶的最适温度(74),),不能保证不能保证PCR扩增产物的特异性扩增产物的特异性引物扩增跨度:以引物扩增跨度:以500bp为宜为宜特定条件下可扩增长至特定条件下可扩增长至10
9、kb的片段的片段引物碱基:引物碱基:G+C含量以含量以40-60%为宜为宜G+C太少扩增效果不佳,太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异过多易出现非特异条带条带ATGC最好随机分布,避免最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列核苷酸的成串排列引物设计的原则(二引物设计的原则(二)避免引物内部出现二级结构避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补,避免两条引物间互补,特别是特别是 3端的互补,否端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异性的扩增条带则会形成引物二聚体,产生非特异性的扩增条带引物引物 3端的碱基要求严格配对端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第
10、二个碱基,以避免因末端特别是最末及倒数第二个碱基,以避免因末端碱基不配对而导致碱基不配对而导致PCR失败失败引物中有或能加上合适的酶切位点引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处切分析或分子克隆很有好处引物设计的原则(三引物设计的原则(三)引物的特异性:引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性源性引物量:引物量:每条引物的浓度每条引物的浓度0.1 1umol或或10 100 pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好以最低引物量产生所需要的
11、结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会可增加引物之间形成二聚体的机会引物设计的原则(四)引物设计的原则(四)RT-PCR 引物设计特别注意:引物设计特别注意:跨越两个外显子跨越两个外显子酶及其浓度酶及其浓度目前有两种目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应聚合酶供应天然酶:从栖热水生杆菌中提纯天然酶:从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶:大肠菌合成基因工程酶:大肠菌合成一个典型的一个典型的 PCR反应约需酶量反应约需酶量 2.5U(指总(指总反应体积为反应体积为100 ul时)时)浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则浓度
12、过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少合成产物量减少dNTP 的质量与浓度的质量与浓度dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关扩增效率有密切关系系dNTP呈颗粒状,呈颗粒状,保存不当易变性失活保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或或1M Tris-HCl的缓冲液将其的缓冲液将其pH调节到调节到7.07.5,小量分装,小量分装,-20冰冻保存。多次冻融冰冻保存。多次冻融会使会使dNTP降解降解在在PCR反应中,反应中,dNTP应为应为50200umol/L,尤其,尤其是注意是注意4种种dNT
13、P的浓度要相等(等摩尔配制的浓度要相等(等摩尔配制),),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量产物的产量dNTP 能与能与Mg2+结合,使游离的结合,使游离的Mg2+浓度降低浓度降低模板(靶基因,模板(靶基因,target genetarget gene)模板核酸的量与纯化程度,是模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否成败与否的关键环节之一的关键环节之一传统的传统的DNA纯化方法通常采用纯化方法通常采用SDS和蛋白酶和蛋白酶K 来消化处理标本来消化处理标
14、本SDS 的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀还能与蛋白质结合而沉淀蛋白酶蛋白酶K 能水解消化蛋白质,特别是与能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合结合的组蛋白的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸模板(靶基因,模板(靶基因,target genetarget gene)提取的核酸即可作为模板用于提取的核酸即可
15、作为模板用于PCR反应反应一般临床检测标本,可采用快速简便的方法一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增扩增RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止法,要防止RNase降解降解RNAMgMg2+2+浓度浓度Mg2+对对PCR扩增的特异性和产量有显著的影扩增的特异性和产量有显著的影响响在一般的在一般的 PCR反应中,各种反应中,各种NTP浓度为浓度为200umol/L时,时,Mg2+浓度为浓度为1.52.0 mm
16、ol/L为宜为宜Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,异扩增,浓度过低会降低浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶聚合酶的活性,使反应产物减少的活性,使反应产物减少PCRPCR反应条件的选择反应条件的选择PCR反应条件反应条件:温度温度时间时间循环次数循环次数温度与时间的设置温度与时间的设置:设置变性设置变性-退火退火-延伸三个温度点延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法,双链标准反应中采用三温度点法,双链DNA在在9095变性,再迅速冷却至变性,再迅速冷却至40 60,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至至
17、7075,在,在Taq DNA 聚合酶的作用下,聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸使引物链沿模板延伸对于较短靶基因(长度为对于较短靶基因(长度为100300bp时)可时)可采用二温度点法,采用二温度点法,将退火与延伸温度合二将退火与延伸温度合二为一,一般采用为一,一般采用94变性,变性,65左右退火左右退火与延伸与延伸 变性温度与时间:变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致变性温度低,解链不完全是导致PCR失败失败的最主要原因的最主要原因一般一般9394lmin足以使模板足以使模板DNA变性变性若低于若低于93则需延长时间则需延长时间但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有但温度不能过高
18、,因为高温环境对酶的活性有影响。影响。此步若不能使靶基因模板或此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全产物完全变性,就会导致变性,就会导致PCR失败失败 退火退火(复性复性)温度与时间:温度与时间:退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要因素特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至4060,可使引,可使引物和模板发生结合。由于模板物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基退火温度与时间,取决于引物的
19、长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度组成及其浓度,还有靶基序列的长度对于对于20个核苷酸,个核苷酸,G+C含量约含量约50%的引物,的引物,55为选择最适退火温度的起点较为理想为选择最适退火温度的起点较为理想引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度:通过以下公式帮助选择合适的温度:Tm值(解链温度)值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度复性温度=Tm值值-(510)在在Tm值允许范围内,选择较高的复性温度可大值允许范围内,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性反应的特异性复性时间一般
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