基于解吸电喷雾质谱成像技术分析番红花球茎中代谢物的组织分布.pdf
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1、 论著 基于解吸电喷雾质谱成像技术分析番红花球茎中代谢物的组织分布陈希,谢星光,冯坤苗,陆颖洁,韩婷(海军军医大学药学系生药学教研室,上海 200433)摘要目的探究不同产地番红花球茎中内源性代谢物的分布特征。方法利用解吸电喷雾(DESI)质谱成像技术,通过优化样品前处理,建立了一种对番红花球茎内源性代谢物可视化分析的方法。结果实现了黄酮、有机酸、氨基酸、类胡萝卜素和环烯醚萜苷等代谢物的原位表征;L-瓜氨酸、苯乙酰甘氨酸、紫苜蓿酚和栀子苷等特异性分布在球茎中;芹菜素7-(6-O-乙酰基)-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、蜀黍氰苷 6-葡萄糖苷、芹菜素 7-O-二葡糖醛酸主要分布在顶芽中;
2、对于在球茎部位分布的化合物,产于上海的番红花球茎丰度最高,浙江次之,安徽最低。结论番红花球茎在不同产地及同一产地不同部位的代谢物分布存在显著差异,黄酮和黄酮衍生物如异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、芹菜素衍生物主要分布于顶芽中,此外,天然植物保护剂蜀黍氰苷 6-葡萄糖苷也主要在顶芽分布,而作为能量和物质供应的氨基酸则主要积累在球茎。关键词 番红花球茎;解吸电喷雾质谱成像;不同产地;不同部位;代谢物分布文章编号 2097-2024(2024)04-0169-04DOI 10.12206/j.issn.2097-2024.202310055Analysisoftissuedistributionofme
3、tabolitesinCrocus sativusL.cormsbasedonDESImassspectrometryimagingtechniqueCHEN Xi,XIE Xingguang,FENG Kunmiao,LU Yingjie,HAN Ting(Department of Pharmacognosy,School of Pharmacy,NavalMedical University,Shanghai 200433,China)AbstractObjectiveTo explore the distribution characteristics of endogenous me
4、tabolites in Crocus sativus L.cormsfrom different origins.MethodsA method based on desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging and optimizedsample pretreatment was developed for directly visualize metabolites in C.sativus corms.ResultsIn situ characterization ofmetabolites such as f
5、lavonoids,organic acids,amino acids,carotenoids,and cyclic enol ether terpene glycosides was achieved.L-Citruline,phenylacetylglycine,sativol,and geniposide were specifically distributed in the corms.Apigenin 7-(6-O-acetyl)-glucoside,isorhamnetin-3-O-D-Glucoside,dhurrin 6-glucoside,and Apigenin 7-O-
6、diglucuronide were mainly distributed in theterminal bud.For compounds distributed in the corms,the highest abundance was found in corms from Shanghai,followed byZhejiang and the lowest from Anhui.ConclusionThe distribution of metabolites in different parts of C.sativus corms fromdifferent origins a
7、nd the same origin varies significantly.Flavonoids and flavonoid derivatives such as isorhamnetin-3-O-D-Glucoside and apigenin derivatives are mainly distributed in the terminal buds,in addition,the natural plant protection agent dhurrin6-glucoside is also mainly distributed in the terminal corms,wh
8、ereas amino acids,which are used as energy and material supplies,are mainly accumulated in the corms.Keywords Crocus sativus L.corms;desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging;different origins;different parts of C.sativus corms;metabolite distribution西红花,为鸢尾科多年生植物番红花(Crocussativus
9、 L.)的干燥柱头,具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等功效 1。番红花是三倍体不育植物,只能通过被称为球茎的块状球茎无性繁殖。西红花的产量和品质与球茎大小直接相关 2。而球茎中包含的有机酸、脂肪酸、萜类等化合物 3与球茎生长代谢过程密切相关,并在很大程度上影响球茎的大小。然而,目前球茎中内源性代谢物的分析方法均需要将样本进行匀浆后检测,这就会造成空间信息的丢失,无法实现原位分析。因此,利用新的技术手段研究番红花球茎中内源性代谢物的空间分布规律至关重要。解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)无需复杂的预处理步骤,可直接对样品进行可视化分析 4。目前已在解析植物内源性代谢物的空间定位方面 基金
10、项目国家自然科学基金面上项目(82174091);上海市崇明区“可持续发展科技创新行动计划”(CK2021-03)作者简介陈希,硕士研究生,研究方向:生药品质优化,Tel:19997980354,Email:通信作者陆颖洁,讲师,研究方向:中药活性物质的原位表征,Email:;韩婷,教授,研究方向:中药活性物质及品质调控,Email: 药学实践与服务2024 年 4 月 25 日第 42 卷第 4 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service,Vol.42,No.4,April 25,2024169 显示出强大的分析能力。本研究通过优化切片厚
11、度,建立了一种灵敏、高覆盖的质谱成像分析方法,以可视化番红花球茎中内源性代谢物在不同产地及同一产地不同部位的空间分布,实现了番红花球茎中黄酮、有机酸、氨基酸、类胡萝卜素和环烯醚萜苷的原位表征。为探究番红花全生命周期内的生长过程和开展番红花球茎种质筛选提供了新的技术支持。1材料和方法 1.1 仪器和试剂1900-冷冻切片机(浙江益迪医疗科技有限公司);SYNAPT G2-Si HDMS 质谱成像仪、HD Imaging质谱成像数据分析软件(Waters 公司);标准级显微镜载玻片(上海泰坦科技股份有限公司)。OCT 包埋剂(美国樱花 SAKURA 公司);甲醇(HPLC 级,美国 Merck 公
12、司)。1.2 样品收集和前处理番红花球茎分别购自上海崇明、浙江建德和安徽亳州西红花种植合作社,批号分别为 20230901SH、20230830ZJ、20230830AH,经海军军医大学韩婷教授鉴定。将新鲜球茎置于冷冻切片机中预冷 30 min之后,用 OCT 包埋剂固定于切片机样品托上。连续切片,分别制备成 20、30、40、50 m 的切片,黏附于载玻片上,在室温下干燥 20 min 后备用。1.3 DESI 质谱成像分析将准备好的组织切片置于 X 轴和 Y 轴二维操控台上,使用 SYNAPT G2-Si HDMS 质谱成像仪在正离子模式下进行检测。检测的质荷比(m/z)范围设定为 506
13、50;空间分辨率为 200 m;施加在电喷雾针上的电压为 3.0 kV;电喷雾针与二维操控台的角度为 38;离子传输管温度为 100;二维操控平台移动速度为 200 m/s。质谱成像原始数据文件利用 HD imaging 软件转化成图片,用总离子流图进行归一化。2结果和讨论 2.1 切片厚度的优化组织切片是获得高质量质谱成像图像的关键步骤 5。组织切片的厚度会影响切片的完整性,如果碎裂就无法获得完整的空间分布图像 6。质谱成像在动物、人体内源性代谢物的可视化分布研究起步较早。对于哺乳动物组织,推荐 520 m 作为检测低分子量的最优厚度 7。然而受限于植物组织富含水分,组织容易破碎的特点,难以
14、制成薄片。为了获得高质量质谱图片,本研究进行了切片厚度的优化。在番红花球茎中,除了水分之外,淀粉是其干物质的重要组成之一 8,因此切片时成形性较差,极易造成组织破碎、结构不完整。本研究选用在 2050 m 之间的浙江建德球茎,以 10 m为梯度,进行了 4 个不同的切片厚度探索。结果表明,切片厚度为 20 m 时,顶芽部位存在大部分缺失,球茎部分也存在部分碎裂;30 m 和 40 m时,顶芽的部位切片完整,但球茎部分仍然不完整,其中 40 m 球茎完整度好于 30 m;而 50 m 切片整体完整度较高,能良好的呈现球茎和顶芽形态(图 1)。因此本研究选择 50 m 切片厚度进行后续质谱成像检测
15、。球茎顶芽20 m30 m40 m50 m图 1不同切片厚度的优化 2.2 代谢物在球茎不同部位中的分布特征使用优化的条件直接进行 DESI-MSI 检测,获得球茎切片在正离子模式下的平均质谱图,如图 2所示,可以观测到丰富的信号峰,其中,m/z 范围在150400 之间信号丰度较高,在 450650 范围内也观察到不少代谢物,但是丰度较低。用总离子流图进行归一化后在 HD imaging 软件中提取质荷比,结合数据库和已报道文献检索,共获得了 66 种化合物的空间分布信息。其中,观察到代谢物在球茎的不同部位具有不同的分布特征。信号强度1057654321050 100 150 200 250
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